基于代謝組學(xué)分析缺血性中風(fēng)痰濕證生物標(biāo)志物特點(diǎn)研究

榮立洋， 李毓秋

（1.三亞市中醫(yī)院，海南三亞 572000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355）

缺血性中風(fēng)（ischemic stroke，IS）是臨床常見病，不僅具有高發(fā)病率的特點(diǎn)，同時(shí)還伴隨著高死亡率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率的臨床特點(diǎn)，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的熱門話題和研究熱點(diǎn)。而隨著人們生活水平的提高、飲食習(xí)慣的不規(guī)律和作息時(shí)間的紊亂等，腦血管病的發(fā)病率逐年增高，尤其是飲食不節(jié)，恣食肥甘厚味，導(dǎo)致越來越多的IS患者表現(xiàn)為明顯的腹部肥胖、舌苔白膩、脈象弦滑等痰濕征象。代謝組學(xué)作為疾病研究的新方向，其核心的系統(tǒng)研究方法在理論上與中醫(yī)理論極為相似[1]，就是利用代謝過程的終端來逆向分析生物機(jī)體的生理病理變化，以了解各種干預(yù)因素對(duì)個(gè)體產(chǎn)生的代謝影響，最終獲得疾病和“證”的特征性代謝物，從而揭示中醫(yī)“證”的本質(zhì)。利用代謝組學(xué)分析IS痰濕證生物標(biāo)志物特點(diǎn)有利于IS疾病的中醫(yī)診斷，對(duì)中醫(yī)辨證有更加科學(xué)的解釋，以及對(duì)臨床應(yīng)用中藥、針灸等中醫(yī)方法治療有借鑒意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年8月～2016年10月在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科住院治療的明確診斷為IS、中醫(yī)證型為痰濕證的13例患者作為病例組（IS痰濕證組），另選取18例體檢正常、中醫(yī)體質(zhì)為平和質(zhì)的山東中醫(yī)藥大學(xué)及附屬醫(yī)院教職工作為正常對(duì)照組（平和質(zhì)組）。IS痰濕證組的平均年齡為（60.35±9.58）歲，平和質(zhì)組為（49.27±11.74）歲，2組的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 缺血性腦卒中的診斷參考2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組制定的《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2010》[2]：注意發(fā)病形式、發(fā)病時(shí)間，排除腦外傷、中毒、癲癇后狀態(tài)、瘤性卒中、高血壓腦病、血糖異常、腦炎及軀體重要臟器功能嚴(yán)重障礙等引起的腦部病變，進(jìn)行必要的實(shí)驗(yàn)室檢查；除非特殊原因不能檢查，所有疑為腦卒中者都應(yīng)盡快進(jìn)行腦部的影像學(xué)（CT或MRI）檢查，排除出血性腦卒中，以確立缺血性腦卒中的診斷。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) （1）中風(fēng)病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1996年由國(guó)家中醫(yī)藥管理局腦病急癥協(xié)作組公布的《中風(fēng)病診斷與療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》[3]。主癥：半身不遂，神識(shí)昏蒙，言語蹇澀或不語，偏身感覺異常，口舌歪斜；次癥：頭痛，眩暈，瞳神變化，飲水發(fā)嗆，目偏不瞬，共濟(jì)失調(diào)；起病方式：急性起病，發(fā)病前多有誘因，且常有先兆癥狀；發(fā)病年齡：多在40歲以上。（2）痰濕證的辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)證候辨治規(guī)范》[4]、《中醫(yī)內(nèi)、外、婦、兒科病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)（試行）》[5]、《中醫(yī)診療常規(guī)》[6]擬定：滿足肥胖、頭悶痛、頭重、口黏膩、渴不欲飲、咳痰或喉中痰鳴、納呆、便溏、胖大舌或齒痕舌、苔厚膩、脈滑中的3項(xiàng)及以上者。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②中醫(yī)證型為痰濕證；③急性起病，且發(fā)病時(shí)間在72 h以內(nèi)；④患者本人或家屬知情并同意參加本研究者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)或發(fā)病超過72 h的患者；②復(fù)發(fā)性中風(fēng)患者；③經(jīng)腦部CT或MRI檢查確診為腦出血或有繼發(fā)性改變的患者（如缺血合并出血中風(fēng)者）；④患者本人或家屬不同意參加本研究者。

1.5 樣本采集及處理

1.5.1 樣本采集 納入樣本時(shí)嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，所有受試者（IS患者入院當(dāng)天），禁食8～12 h后，于清晨靜息30 min后抽取空腹靜脈血，離心后分離血清，置-80℃冰箱保存。

1.5.2 血清樣本處理 在進(jìn)行核磁共振測(cè)試前，將凍存的血液在室溫下復(fù)蘇，血清樣品各吸取上清400μL，樣品于1.5 mL離心管中；先后加入30μL含 0.05%2，2，3，3-三甲基甲硅烷基丙酸鈉（TSP）的重水配制的磷酸緩沖液（K2HPO4/NaH2PO4，1.5 mol/L，pH=7.4）和170μL 重水1 min混勻。在4℃，12 000 r/min條件下離心10 min，取500μL上清液置于直徑5 mm的核磁共振管。

1.6 血清生物代謝產(chǎn)物檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)設(shè)備為Varian Inova 600M Agilent。血清核共振譜圖積分間距0.2× 10-4，積分區(qū)間0.5× 10-6～9.0× 10-6，去掉一段4.75×10-6～4.90×10-6（包含殘余的水峰及其影響的區(qū)域）。使用處理軟件（Mest Re Nova V9.0.1）對(duì)譜圖進(jìn)行傅立葉變換，完成基線校正、相位調(diào)整及定標(biāo)等。為提高信噪比，所有譜圖進(jìn)行傅立葉變換時(shí)乘以增寬因子為1 Hz的指數(shù)窗函數(shù)。

1.7 主成分分析（PCA） 運(yùn)用SIMCA軟件（V14.1，MKS Data Analytics Solutions，Umea，Sweden），使用中心化（CTR）加對(duì)數(shù)（LOG）轉(zhuǎn)換對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行格式化處理，隨后開始自動(dòng)建模分析。

1.8 正交偏最小二乘法—判別分析（OPLS-DA） 利用7折交叉驗(yàn)證（7-fold cross validation）對(duì)使用SIMCA軟件分析OPLS-DA建模的結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證，得到R2Y、Q2（模型對(duì)分類變量Y的可解釋性和模型的可預(yù)測(cè)性），通過置換檢驗(yàn)，進(jìn)一步檢驗(yàn)其有效性。

2 結(jié)果

2.1 生物代謝產(chǎn)物（PCA）分析結(jié)果 IS痰濕證組與平和質(zhì)組的PCA得分散點(diǎn)圖顯示：2組樣本區(qū)分顯著，樣本全部處于99%置信區(qū)間內(nèi)。結(jié)果見圖1。

2.2 生物代謝產(chǎn)物OPLS-DA分析結(jié)果 IS痰濕證組與平和質(zhì)組的OPLS-DA得分散點(diǎn)圖見圖2，OPLS-DA載荷圖見圖3。圖3橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移的大小，從右到左，化學(xué)位移值越來越大；縱坐標(biāo)表示經(jīng)過回溯轉(zhuǎn)換后載荷值的大小，其中顏色的深淺表示相關(guān)系數(shù)的大小，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)。圖中標(biāo)記物質(zhì)[肌酸（Cr）、檸檬酸（Cit）、內(nèi)酯（Act）、乙酸（Ace）、亞麻酸（Ala）、甲酸（For）、1-甲基組氨酸（1-MH）]均為通過相關(guān)系數(shù)臨界值檢驗(yàn)的差異代謝物。

圖1 IS痰濕證組與平和質(zhì)組的PCA得分散點(diǎn)圖Figure 1 Scatter diagram of PCA scores in IS patients with phlegm-dampness syndrome and healthy volunteers with balanced constitution

2.3 生物代謝產(chǎn)物OPLS-DA置換檢驗(yàn) IS痰濕證組與平和質(zhì)組OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果見圖4。圖4橫坐標(biāo)為置換保留度，原模型的R2和Q2值處于置換保留度等于1處的點(diǎn)，縱坐標(biāo)為R2或Q2的取值，R2值（綠色圓點(diǎn)）與Q2（藍(lán)色方點(diǎn)）構(gòu)成的兩條虛線為二者的回歸線。原模型R2和Q2均接近1，說明建立模型不僅符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況，且如有新樣本加入對(duì)原有分布情況影響不大，所以該模型可以充分解釋2組樣本之間的差異。

2.4 差異代謝物的篩選 通過分析OPLS-DA模型每種代謝物的相關(guān)系數(shù)，進(jìn)一步總結(jié)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物。在相關(guān)系數(shù)圖中，將每一個(gè)變量的loading值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差相乘后進(jìn)行數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換，然后與相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)臨界值表進(jìn)行比對(duì)，可篩選出最終的組間差異代謝物。表1結(jié)果顯示：IS痰濕證患者較健康人群血清中代謝物差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的有1-甲基組氨酸、醋酸、丙氨酸、丙酮、檸檬酸、肌酸、乙醇胺、甲酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異丁酸、異亮氨酸、乳酸、低密度脂蛋白、亮氨酸、脂質(zhì)、賴氨酸、甲醇、蛋氨酸、肌醇、N-乙酰糖蛋白、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、極低密度脂蛋白、α-葡萄糖、β-葡萄糖。

圖2 IS痰濕證組與平和質(zhì)組的OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Figure 2 Scatter diagram of OPLS-DA scores in IS patients with phlegm-dampness syndrome and healthy volunteers with balanced constitution

圖3 IS痰濕證組與平和質(zhì)組的OPLS-DA載荷圖Figure 3 OPLS-DA loading plots in IS patients with phlegm-dampness syndrome and healthy volunteers with balanced constitution

3 討論

3.1 氨基酸代謝差異物 以上結(jié)果表明，30種代謝產(chǎn)物可能為IS痰濕證患者潛在的生物標(biāo)志。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最終差異代謝產(chǎn)物大部分來自于氨基酸代謝，氨基酸不僅參與蛋白質(zhì)合成，同時(shí)也參與嘧啶、嘌呤、卟啉等生物合成，所以氨基酸代謝也成為了代謝組學(xué)的研究重點(diǎn)。本研究中OPLS-DA相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值越大，說明差異越明顯。

圖4 IS痰濕證組與平和質(zhì)組OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Permutation test results for OPLS-DA model in IS patients with phlegm-dampness syndrome and healthy volunteers with balanced constitution

神經(jīng)系統(tǒng)中有大量的游離氨基酸，如谷氨酸（Glu）、組氨酸（Gly）等[4]，尤其是腦脊液中，Glu含量最高。正常情況下，維持腦組織中游離氨基酸高濃度和血清間低濃度的濃度梯度差依賴于血腦屏障，當(dāng)IS發(fā)生后破壞了血腦屏障，腦脊液含量增加，大量氨基酸也透過血腦屏障進(jìn)入了外周血液[5]。Glu作為腦脊液中的重要物質(zhì)，參與多種大腦認(rèn)知與神經(jīng)生理活動(dòng)，正常情況下，由于血腦屏障的原因，Glu無法通過血液直接供給于腦，而是必須通過生物化學(xué)途徑在腦內(nèi)合成以完成腦內(nèi)代謝，所以IS痰濕證患者Glu相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值較大，差異度較高，可能與血腦屏障的破壞有直接關(guān)系。谷氨酰胺酶抑制劑6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸可減少Glu的釋放，所以IS痰濕證患者谷氨酰胺（Gln）的含量異常很可能激活了中樞神經(jīng)系統(tǒng)自我保護(hù)機(jī)制。除此之外，作為人體必須的氨基酸之一的賴氨酸（Lys），可以通過血腦屏障，幫助血腦屏障保持良好的通透性，促進(jìn)腦組織的生長(zhǎng)[6]，所以隨著血腦屏障的破壞，IS痰濕證患者腦脊液中Lys含量與外周血中含量比會(huì)發(fā)生明顯異常。

當(dāng)IS發(fā)生時(shí)，腦組織會(huì)出現(xiàn)缺血缺氧、生化功能異常、血流量受限、葡萄糖供應(yīng)不足等情況，同時(shí)糖酵解產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸下降加劇了三羧酸循環(huán)無氧糖酵解反應(yīng)[7]。有研究[8]表明，腦梗死大鼠血漿中葡萄糖-6-磷酸、核糖含量減少，而檸檬酸含量增多，因此，在減少氧氣水平的情況下，糖酵解的增加和氧化檸檬酸循環(huán)通量的減少也可能是IS痰濕證患者氨基酸代謝異常的原因之一。同時(shí)，在葉酸代謝通路中，葉酸氧化過程需要甲酸通過葉酸結(jié)合四氫葉酸、甲酰四氫葉酸合成酶，介導(dǎo)形成10-甲酰四氫葉酸形式。除此之外，絲氨酸四氫葉酸也可合成甘氨酸，所以腦缺血后血清中會(huì)出現(xiàn)甲酸升高、葉酸減少、甘氨酸減少的情況[9]。因此，本試驗(yàn)中IS痰濕證患者甲酸與甘氨酸代謝物差異可能與葉酸代謝通路密切相關(guān)。

表1 2組間差異代謝物及OPLS-DA相關(guān)系數(shù)Table 1 Differential metabolites and OPLS-DA correlation coefficients in the two groups

3.2 能量代謝差異物 當(dāng)腦區(qū)嚴(yán)重缺血，神經(jīng)元死亡、糖代謝下降相繼出現(xiàn)，因此，能量代謝障礙成為腦損傷的根本原因。而在未嚴(yán)重缺血的腦區(qū)則發(fā)生糖代謝率增加，葡萄糖無氧酵解增加，乳酸增多導(dǎo)致輕微酸中毒以形成局限性缺血保護(hù)作用。乳酸、肌酸含量異常均出現(xiàn)在腦中風(fēng)發(fā)作后，尤其是乳酸的升高被認(rèn)為是早期缺血的敏感指標(biāo)[10]。IS痰濕證患者中存在α-葡萄糖、β-葡萄糖、乳酸、肌酸代謝差異，說明能量代謝發(fā)生明顯異常。與此同時(shí)，在IS痰濕證患者與平和質(zhì)的對(duì)比試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)存在丙酮代謝物差異，丙酮為脂肪酸氧化的中間產(chǎn)物，脂肪酸β氧化也是腦組織除葡萄糖無氧酵解途徑外的重要能量代謝。三羧酸循環(huán)是機(jī)體獲取能量的主要方式，是線粒體內(nèi)進(jìn)行的連續(xù)反應(yīng)，其中亮氨酸和部分異亮氨酸可以轉(zhuǎn)換成乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)以提供能量[11-12]。

3.3 脂類代謝差異物 由本研究結(jié)果可知，IS痰濕證患者存在脂質(zhì)-CH2-C=O、脂質(zhì)-CH2-CH=CH-、脂質(zhì)=CH-CH2-CH-、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白代謝物差異。已知脂類代謝與動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性心腦血管疾病關(guān)系十分密切，除此之外，痰濕證也與脂類代謝密不可分。筆者前期做過的相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在亞健康人群中，痰濕質(zhì)人群的血脂異常率約為90.2%。膽堿作為可以促進(jìn)腦發(fā)育和提高記憶能力的重要物質(zhì)，在促進(jìn)脂蛋白構(gòu)成、調(diào)節(jié)脂肪代謝、降低血清膽固醇等方面起著重要的作用。乙醇胺常存在于磷脂中，與膽堿共存，本試驗(yàn)驗(yàn)證了在IS痰濕證患者中乙醇胺存在代謝物差異，說明脂類代謝異常影響IS痰濕證的發(fā)生發(fā)展。

3.4 總結(jié) 綜上所述，IS痰濕證患者血清代謝差異物主要涉及氨基酸代謝、能量代謝、脂類代謝，其中與血腦屏障破壞、腦神經(jīng)自我保護(hù)機(jī)制、糖代謝、三羧酸循環(huán)、脂肪酸β氧化等環(huán)節(jié)密切相關(guān)。我國(guó)代謝組學(xué)研究起步較晚，尤其在IS疾病研究方面存在大量空白，IS疾病的發(fā)生發(fā)展也涉及眾多環(huán)節(jié)，因此，在今后的研究中不能局限于單一因素、單一環(huán)節(jié)、單一通路，要建立多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模式，以提高腦梗死的防治水平，以便更好地控制和預(yù)防IS疾病的發(fā)生。