減味壽胎丸對藥源性卵巢功能損傷大鼠干預(yù)時(shí)機(jī)的探討*

★ 管雁丞 黃長盛 倪張俊 指導(dǎo)：羅頌平（.深圳市中醫(yī)院婦產(chǎn)科 廣東 深圳 58000；2.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院（深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院）中醫(yī)（風(fēng)濕）科 廣東 深圳 58052；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 廣州 50405）

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD雌性SPF級大鼠，重約220～250g（廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號，SYXK（粵）2008-0001）。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物房。

1.2 試藥 減味壽胎丸：菟絲子、桑寄生、續(xù)斷按2：1：1比例混合，采用醇提與水提法，混合總提物，提取率為45%（廣東優(yōu)力生物科技有限公司完成，樣品批號：201111030201-201111030204）。按人與大鼠體表面積折算系數(shù)6.25進(jìn)行換算，即大鼠給藥劑量為1.875g/kg/d；低劑量組為1倍等效劑量，高劑量組為4倍等效劑量。

戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂）片（1mg/片，DELPHARM Lille S.A.S產(chǎn)，生產(chǎn)批號：278A），配置成0.5mg/mL藥物濃度。雷公藤多苷懸浮液（黃石飛云制藥有限公司，產(chǎn)品批號：20151203），配置成濃度為75mg/kg的懸浮液。

1.3 分組與方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后選取有正常動(dòng)情周期大鼠90只，隨機(jī)分成正常組、前期干預(yù)模型組、前期干預(yù)補(bǔ)佳樂組、前期干預(yù)中藥高、低劑量組，后期干預(yù)模型組、后期干預(yù)補(bǔ)佳樂組、后期干預(yù)中藥高、中藥低劑量組，每組各10只。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 正常組分別于上午9時(shí)及下午3時(shí)灌服3mL生理鹽水，連續(xù)30天；早期干預(yù)模型組上午9時(shí)灌服GTW，下午3時(shí)灌服生理鹽水；早期干預(yù)用藥組上午9時(shí)灌服GTW，下午3時(shí)灌服減味壽胎丸或戊酸雌二醇，均連續(xù)30天。后期干預(yù)模型組在定時(shí)連續(xù)灌服GTW30天后，改予3mL生理鹽水，晚期干預(yù)用藥組改予減味壽胎丸或戊酸雌二醇，均連續(xù)30天，共60天。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 動(dòng)情周期的變化 觀察方法[1]如下：動(dòng)情前期：全部見有核上皮細(xì)胞，偶見少量角化細(xì)胞。動(dòng)情期：全部見無核角化細(xì)胞，間有少量白細(xì)胞。動(dòng)情后期：細(xì)胞成分多，可見白細(xì)胞，角化細(xì)胞及有核上皮細(xì)胞。動(dòng)情間期：可見有大量的白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞和粘液。

1.5.2 血清FSH、LH、E2、INHB、AMH的檢測 大鼠最后一次灌胃后1～5天內(nèi)，選擇非動(dòng)情期腹主動(dòng)脈取動(dòng)脈血、處死。血清FSH、LH、E2以RIA法測定（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成）；血清INHB、AMH以ELISA法測定。

1.5.3 卵泡計(jì)數(shù) 大鼠處死后摘取雙側(cè)卵巢、子宮，并盡可能的剔除粘附脂肪等組織。將左側(cè)卵巢在電子秤上稱濕重后，計(jì)算卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)。計(jì)算公式如下：

卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)=卵巢、子宮重量/大鼠體重×100%

同時(shí)，將右側(cè)卵巢標(biāo)本用10%多聚甲醛固定，包埋、切片，觀察卵泡計(jì)數(shù)。各級卵泡分類標(biāo)準(zhǔn)描述參閱文獻(xiàn)[1]。原始卵泡計(jì)數(shù)以卵母細(xì)胞核作為標(biāo)記物。竇前卵泡和竇狀卵泡計(jì)數(shù)以卵母細(xì)胞核仁為標(biāo)記物觀察每張切片。按照上述方法，計(jì)數(shù)每個(gè)標(biāo)本卵泡及黃體數(shù)。采用單盲法獨(dú)立觀察所有切片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)情周期 以兩個(gè)動(dòng)情周期8～10天作為觀察點(diǎn)。結(jié)果表1-2。結(jié)果表明，前期干預(yù)模型組隨著造模時(shí)間的延長，在D11-D20已出現(xiàn)過半大鼠動(dòng)情周期的紊亂、延長，到最后全部大鼠均出現(xiàn)動(dòng)情周期的變化。前期干預(yù)西藥組及減味壽胎丸高、低劑量均可使部分大鼠動(dòng)情周期恢復(fù)，其中，高劑量組有一半大鼠恢復(fù)正常的動(dòng)情周期。后期干預(yù)模型組隨著造模時(shí)間的延長，動(dòng)情周期未能恢復(fù)。后期干預(yù)西藥組及減味壽胎丸高、低劑量均可使部分大鼠動(dòng)情周期恢復(fù)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無意義（P＞0.05）。

表1 大鼠前期干預(yù)動(dòng)情周期的變化（n=10） 只

表2 大鼠后期干預(yù)動(dòng)情周期的變化（n=10） 只

2.2 血清性激素水平變化 前期干預(yù)西藥組可明顯升高E2水平；前期干預(yù)西藥組、減味壽胎丸高、低劑量組均可明顯降低FSH、FSH/LH比值的水平，三組組間比較無差異；后期干預(yù)各治療組及各組LH組間比較均無明顯差異。

2.3 血清細(xì)胞因子比較 中藥低劑量組可明顯升高INHB、AMH水平，前、后干預(yù)各治療組均未見明顯變化。

表2 大鼠前、后期干預(yù)血清性激素的變化（，n=10）

表2 大鼠前、后期干預(yù)血清性激素的變化（，n=10）

注：與正常組比較，★P＜0.05。與前期模型組比較，*P＜0.05。與后期模型組比較，ΔP＜0.05。

組別 E2/pg·mL-1 FSH/mIU·mL-1 LH/mIU·mL-1 FSH/LH正常組 7.61±7.51 0.65±0.45 0.5±0.25 1.33±7.54前+模組 1.48±1.1★ 1.59±0.9★ 0.98±0.69 2.29±1.91★前+西組 4.73±4.54★* 1.10±0.21★* 0.89±0.15 1.22±0.44*前+中高組 2.76±3.08★ 0.95±0.15* 0.91±1.76 1.13±0.87*前+中低組 1.57±1.43★ 1.2±0.16★* 0.96±0.13 1.24±0.05*后+模組 1.10±2.14★ 1.26±0.34★ 0.73±0.44 1.24±0.09★后+西組 2.05±2.48★ 1.12±0.45★ 0.89±0.27 0.24±0.09后+中高組 2.52±3.08★ 1.11±0.35★ 0.82±0.22 1.33±0.18后+中低組 2.21±2.85★ 1.07±0.25★ 0.87±0.17 1.23±0.64

表3 大鼠前、后干預(yù)血清細(xì)胞因子的變化（，n=10） ng/mL

表3 大鼠前、后干預(yù)血清細(xì)胞因子的變化（，n=10） ng/mL

注：與正常組比較，★P＜0.05。與前期模型組比較，*P＜0.05。與后期模型組比較，ΔP＜0.05。

組別 INHB AMH正常組 41.1±5.17 10.06±1.23前+模組 35.81±3.61★ 8.4±0.94★前+西組 34.23±4.98★ 8.18±1.33★前+中高組 36.08±4.61★ 8.75±1.19★前+中低組 39.74±3.52★* 9.62±1.74*后+模組 33.35±4.62★ 8.65±1.15★后+西組 33.38±6.11★ 8.27±1.11后+中高組 37.18±1.95★ 7.94±0.75后+中低組 31.37±5.78★ 8.38±0.79

2.4 大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)變化 前期干預(yù)中藥低劑量組可明顯升高卵巢指數(shù)，前后期干預(yù)組均未見子宮指數(shù)明顯升高。

表4 大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)的變化（，n=10）%

表4 大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)的變化（，n=10）%

注：與正常組比較，★P＜0.05。與前期模型組比較，*P＜0.05。與后期模型組比較，ΔP＜0.05。

組別 卵巢指數(shù) 子宮指數(shù)正常組 0.024±0.002 0.23±0.084前+模組 0.018±0.005★ 0.203±0.102前+西組 0.023±0.003 0.203±0.06前+中高組 0.020±0.003 0.15±0.015★前+中低組 0.026±0.005* 0.164±0.031★后+模組 0.014±0.053★ 0.169±0.06★后+西組 0.019±0.05Δ 0.15±0.023★后+中高組 0.023±0.003Δ 0.203±0.074后+中低組 0.017±0.005Δ 0.162±0.047★

2.5 大鼠卵泡計(jì)數(shù)比較 大鼠生長卵泡的比較：前期干預(yù)西藥組未能明顯使生長卵泡數(shù)量增加，減味壽胎丸高、低劑量組可使生長卵泡增加，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無意義。后期干預(yù)中藥高劑量組可明顯使生長卵泡數(shù)量增加。前期干預(yù)西藥組可使成熟卵泡/卵泡總數(shù)比值明顯升高；后期干預(yù)各組均可使比值升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組黃體數(shù)組間比較無明顯差異。

表5 大鼠前、后期干預(yù)卵泡計(jì)數(shù)的比較（，n=10）個(gè)

表5 大鼠前、后期干預(yù)卵泡計(jì)數(shù)的比較（，n=10）個(gè)

組別 生長卵泡 成熟卵泡/卵泡總數(shù) 黃體數(shù)正常組 12.5±5.66 0.25±0.06 5.4±3.03前+模組 11±7.02 0.17±0.08 4.2±1.93前+西組 8.8±6.56 0.41±0.26★* 3.5±2.59前+中高組 11.4±7.96 0.21±0.14 4.6±1.65

（續(xù)表）

3 討論

“治未病”最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)靈樞·順逆》，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)預(yù)防為主的思想，是中醫(yī)理論體系的重要組成部分，在后世亦得到了不斷發(fā)展和完善，它包括了“未病先防”“既病防變”“瘥后防復(fù)”三個(gè)方面，三者的重點(diǎn)在于“防”。所謂未病先防，即著眼于未雨綢繆，保身長全，預(yù)防疾病的發(fā)生，是“治未病”的第一要義。

筆者研究團(tuán)隊(duì)已多次重復(fù)并成功建立藥源性卵巢功能損傷大鼠模型，結(jié)果顯示75mg/kg，連續(xù)用藥30天模型穩(wěn)定[2]；減味壽胎丸拮抗修復(fù)卵巢功能損傷效顯且三月齡性成熟大鼠干預(yù)效果最佳[3]。故本實(shí)驗(yàn)基于“治未病”學(xué)說，將實(shí)驗(yàn)設(shè)立為前期干預(yù)及后期干預(yù)兩個(gè)部分。前期干預(yù)即在灌服雷公藤的造模同時(shí)，給予治療藥物干預(yù)；后期干預(yù)即造模成功后，給予治療藥物干預(yù)，以觀察前期干預(yù)與后期干預(yù)的差異性，進(jìn)一步探討雷公藤致卵巢功能損傷大鼠最佳干預(yù)時(shí)機(jī)，以期指導(dǎo)臨床用藥，減少藥物的副作用，提高藥物利用度。

結(jié)果表明，前期干預(yù)組，減味壽胎丸可使3月齡大鼠約半數(shù)動(dòng)情周期恢復(fù)；可使FSH、FSH/LH明顯降低，E2、AMH、INHB水平明顯升高；可使卵巢指數(shù)明顯升高；可使成熟卵泡/卵泡總數(shù)比值明顯升高；可使生長卵泡增加，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無意義。后期干預(yù)組，中藥高劑量組可明顯使生長卵泡數(shù)量增加，未見明顯性激素及細(xì)胞因子的明顯變化。可見，前期干預(yù)對于卵巢功能損傷的修復(fù)效果更顯著，后期干預(yù)各組雖有效，但均無顯著性改善。

綜上所述，減味壽胎丸前期干預(yù)拮抗修復(fù)藥源性卵巢功能損傷顯效，后期干預(yù)無效。