蠐螬對激光損傷兔血-視網(wǎng)膜屏障后視網(wǎng)膜白細胞介素-1表達影響的研究*

★ 楊霞 蔣鵬飛 彭俊 彭清華 *** 張波濤 葉群如 江運長（.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長沙 40208；2.湖北航天醫(yī)院 武漢 42000；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長沙 40007）

隨著激光在眼科檢查及治療的廣泛應(yīng)用，由激光所致的醫(yī)源性視網(wǎng)膜光損傷也越來越多，許多眼科疾病的發(fā)生與視網(wǎng)膜長期光照的積累效應(yīng)有關(guān)[1-2]，如老年性黃斑變性。中藥蠐螬是金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子或其他近緣昆蟲的干燥幼蟲，屬蟲類藥，味咸微溫，有毒，在眼科應(yīng)用較早?！稌x書》中有此藥治療目疾的記載：“吳中書郎戰(zhàn)沖，母王氏失明，婢取蠐螬蒸熟與食，王以為美，沖還知之，抱母慟哭，母目即開。”為觀察不同劑量蠐螬提取物在視網(wǎng)膜光損傷后組織抗炎癥反應(yīng)中的作用，本研究應(yīng)用不同劑量蠐螬提取物干預(yù)白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1），觀察其視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)學(xué)改變，探討蠐螬提取物對視網(wǎng)膜光損傷兔模型保護作用的最佳劑量。

1 材料

1.1 實驗動物 選用30只健康實驗性兔，均為雄性，體重1.8～2.3Kg（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室提供，合格證號：醫(yī)動字第20-002號）。

1.2 主要實驗藥品和試劑 蠐螬提取物（參照參考文獻[3]所用制備方法制得）、Harris蘇木素（湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理實驗室，批號：71020784）、PV9000型二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號：zb-5301）、細胞裂解液（江蘇碧云天，批號：P0013）、羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB23303）。

1.3 主要儀器設(shè)備和手術(shù)器材 電子秤（上海天平儀器廠， JY0001）、眼科手術(shù)顯微鏡（蘇州醫(yī)療器械設(shè)備廠， YZZOT）、微量移液器（德國，eppendorf（1mL/200μL/10μL））、水平搖床（北京六一儀器廠，WD-9405B）、壓片夾（koda）、掃描儀（日本Canon，9000F MarkⅡ）。

2 實驗方法

2.1 分組方法 將30只實驗性兔依次編為1～30號，通過隨機數(shù)字表法：從隨機數(shù)字表第3行第5個數(shù)開始抄錄30個數(shù)，令這些數(shù)字除以5，余數(shù)為1劃入空白組（A），余數(shù)為2劃入模型組（B），余數(shù)為3劃入蠐螬低劑量組（C），余數(shù)為4劃入蠐螬中劑量組（D），余數(shù)為0劃入蠐螬高劑量組（E），最終使每組6只動物，12只眼。

2.2 造模方法 采用自制光化學(xué)損傷裝置[3]：在光照架的6個面分別放置1根40W的白色熒光燈管。調(diào)節(jié)光照強度，并用ZDS-10型數(shù)字式照度計測定大鼠活動水平多點照度，平均為2000±200 1x。動物房的室溫控制在21℃～24℃，光照箱內(nèi)的平均溫度為22℃～25℃。所有實驗動物在12h明（30-50 1x）及12h暗環(huán)境下循環(huán)光環(huán)境適應(yīng)7d，自由攝食飲水。7d后光照前先暗適應(yīng)24h，然后光照12h（晚上8：00至次日早上8：00），再進行暗適應(yīng)12h，連續(xù)3個循環(huán)，光照時間總計為36h。實驗性兔不散瞳及麻醉，可在光照箱內(nèi)自由活動，光照后送回暗環(huán)境中飼養(yǎng)。A組不施行光照試驗。

2.3 給藥方法 A、B組每日以生理鹽水5mL/Kg灌胃；C組按照0.45g/Kg配成5mL蠐螬提取物混懸液；D組按照成人日用量10倍劑量灌胃，為0.9g/Kg蠐螬提取物配成5mL蠐螬提取物混懸液；E組按照成人日用量20倍劑量灌胃，為1.8g/Kg蠐螬提取物配成5mL蠐螬提取物混懸液。每日灌胃1次，給藥7d、14d分別處死3只兔子后取材做IL-1免疫組化檢測。

2.4 取材方法 動物耳緣靜脈注射空氣處死后，于角膜緣后0.5mm處剪開眼球壁，將眼球壁在手術(shù)顯微鏡下剝離激光斑部位視網(wǎng)膜，脫水、石蠟包埋后切片烘干備用。

2.5 指標檢測

2.5.1 HE染色觀察標本視網(wǎng)膜細胞結(jié)構(gòu) 經(jīng)脫水浸蠟、二甲苯溶液脫蠟、無水乙醇洗蠟、乙醇浸泡、自來水洗、蘇木素染色、乙醇鹽酸分色、伊紅染色、乙醇分色脫水、二甲苯溶液透明、中性樹膠封片等步驟，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.5.2 IL-1免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟，用PBS（0.01mol/L，pH=7.4）沖洗5min×3次，3% H2O2室溫孵育10min，蒸餾水沖洗，滴加IL-1單克隆抗體，室溫或37℃孵育1～2h，PBS沖洗2min×3次，滴加1：100比例稀釋的一抗，37℃孵育1h，PBS沖洗2min×3次，滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗2min×3次， DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，封片。在高放大倍率顯微鏡下觀察到IL-1蛋白的表達。標準如下：免疫組織化后，細胞質(zhì)為棕色或深棕色為陽性標記。使用高倍顯微鏡隨機選擇5個視網(wǎng)膜視野用于圖像分析系統(tǒng)定量測量各個指標陽性積分光密度，以此表示它們的含量。

3 結(jié)果

3.1 各組實驗性兔視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果 A組：實驗性兔視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明。B組：視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)模糊，分界不清，出現(xiàn)不規(guī)則淡染。C組：視網(wǎng)膜外核層胞核排列較疏松。D組：視網(wǎng)膜外核層增厚，視網(wǎng)膜外核層胞核排列較整齊密集。E組：視網(wǎng)膜外核層胞核排列較整齊，厚度有增加。具體見圖1。

3.2 各組實驗性兔視網(wǎng)膜IL-1的表達情況 A組視網(wǎng)膜外核層中IL-1陽性物質(zhì)分布稀疏，含量較少；B組視網(wǎng)膜外核層中IL-1陽性物質(zhì)彌漫分布，含量較多；其余各組視網(wǎng)膜外核層中IL-1陽性物質(zhì)有不同程度減少。見表1。

表1 各組間大鼠視網(wǎng)膜IL-1表達的比較（，n=6）

表1 各組間大鼠視網(wǎng)膜IL-1表達的比較（，n=6）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別 第一周 第二周A組 6.08±3.46▲ 5.06±3.17▲B組 162.98±59.34＊ 101.48±13.09＊C組 74.64±9.31＊▲ 43.41±0.42＊▲D組 66.59±0.87＊▲ 32.63±2.26＊▲E組 67.26±1.46＊▲ 36.92±1.45＊▲

4 討論

眼底激光作為高能量的單色光，其對視網(wǎng)膜的灼傷屬于眼外傷范疇，多導(dǎo)致視衣氣陰受損，氣虛血瘀。目珠脈道幽深細微，經(jīng)絡(luò)分布周密，氣血縱橫貫?zāi)?，若激光灼傷目珠，氣陰受損，脈絡(luò)瘀滯，使神光發(fā)越受阻，視功能減退。目得陰血而能視，氣脫者目不明，神光賴其真氣真血真精之滋養(yǎng)，方能明視萬物。益氣則神光有所滋養(yǎng)，同時，氣旺以促血行；活血化瘀則目珠脈道通暢，氣血可以縱橫貫?zāi)?，神光方能有所發(fā)越。故治療常以益氣活血化瘀為主，輔以養(yǎng)陰利水。蠐螬在《神農(nóng)本草經(jīng)》中最早有記載：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅滿痛，月閉，目中淫膚、青翳白膜?！毕擉┯谢钛鲋В舍槍σ暰W(wǎng)膜光損傷的脈絡(luò)瘀滯病機治療。

由于持續(xù)的光照，活性脂肪酸代謝和高氧消耗，視網(wǎng)膜光感受器細胞發(fā)生慢性氧化應(yīng)激[4-5]，導(dǎo)致細胞內(nèi)循環(huán)和降解減少，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡[6]。感光細胞的大量凋亡是視網(wǎng)膜光損傷后視力下降的主要原因[7-10]。

IL-1不僅是細胞炎癥因子，也是炎癥前細胞因子，IL-1聚集往往炎癥發(fā)生[11-12]。IL-1具有趨化和有絲分裂作用，還能引起組織產(chǎn)生增殖反應(yīng)。在視網(wǎng)膜上，IL-1主要由視網(wǎng)膜Müller細胞表達，主要形式為IL-1β，IL-1β可以使視網(wǎng)膜組織間隙增大，有利于炎癥因子的滲出，從而加劇炎癥反映，破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，尤其是血-視網(wǎng)膜屏障的破壞。

本實驗發(fā)現(xiàn)模型組IL-1表達增強，蠐螬中、高劑量治療組IL-1表達減少。這提示視網(wǎng)膜光損傷可能通過激活細胞炎癥反應(yīng)，引起視網(wǎng)膜損傷，而蠐螬可能通過抑制細胞炎癥反應(yīng)，對視網(wǎng)膜光損傷起到保護作用。