小鼠亞急性烏頭堿中毒的臟器系數(shù)和血液生化指標(biāo)分析

王 輝，劉彥兵，黃恩霞，寧璐璐，劉奕伶，楊 琳，楊涵琪，郭 蓉，趙寶玉，路 浩

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

烏頭又名附子，為毛莨科烏頭屬植物烏頭(Aconitumcarmichaeli)，全世界烏頭屬(AconitumL.)植物約有350種，包含烏頭亞屬(SubgenAconitum)、牛扁亞屬(SubganParaconitum)和露芯烏頭亞屬(SubgenGymnaconitum)3個(gè)亞屬[1]，其中烏頭亞屬植物品種最豐富，牛扁亞屬較少，露蕊烏頭亞屬只有露蕊烏頭1種[2]，常見的品種有烏頭，北烏頭，短柄烏頭等[3]。我國烏頭屬植物約200種，大多數(shù)分布于西南橫斷山區(qū)，其次分布于東北各省[4]。

烏頭毒性強(qiáng)吸收快，引起中毒過程迅速，可在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生[5]。烏頭中毒的主要靶器官是神經(jīng)系統(tǒng)和心臟，具有致心率失常，抑制呼吸中樞，興奮迷走中樞等毒理作用，動(dòng)物采食后會(huì)引起以流涎、嘔吐、腹瀉、心律失常、視覺和聽覺減弱、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)障礙等為特征的中毒病[6]，可引起動(dòng)物中毒死亡，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成一定經(jīng)濟(jì)損失。

目前研究表明，生物堿是烏頭的主要化學(xué)成分和活性成分，也是其毒性成分。雙脂型生物堿在烏頭各類生物堿中毒性最大，主要有烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，其中以烏頭堿(Aconitine)毒性最強(qiáng)，為烏頭的主要毒性成分[6]。烏頭堿具有多種藥理作用，主要表現(xiàn)為抗心律失常、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫等方面[7]，而有關(guān)烏頭堿的毒性研究則相對(duì)較少，特別是其對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響尚不清楚。鑒于此，本試驗(yàn)擬通過復(fù)制小鼠亞急性烏頭堿中毒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接憺躅^堿對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響，為烏頭堿毒性作用機(jī)制研究及動(dòng)物烏頭中毒病防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 7日齡健康清潔級(jí)昆明系小鼠，雌雄各半，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2主要試劑及儀器 98.86%烏頭堿(成都曼思特)、1%稀鹽酸、1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液、生理鹽水；電子天平、雷磁PHS-3 EpH計(jì)、TGL-16G離心機(jī)、全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(BC-2800vet)，AST、ALT試劑盒(上海復(fù)星長(zhǎng)征公司);BUN、CRE、GLU、TC、TG試劑盒(上海科華公司);ALB、TP試劑盒(中生北控公司);全自動(dòng)生化分析儀(上海迅達(dá)公司)。

1.3 小鼠亞急性烏頭堿中毒模型的建立 將120只小鼠隨機(jī)分為4組，雌雄各半，即對(duì)照組(生理鹽水)、低劑量組(0.14 μmol/L)、中劑量組(0.28 μmol/L)、高劑量組(0.56 μmol/L)，連續(xù)灌胃30 d。

1.4 臨床癥狀觀察 每天觀察并記錄各試驗(yàn)組小鼠的飲食狀況，精神狀態(tài)，行為活動(dòng)及臨床癥狀等變化。

1.5 體重測(cè)定 分別于第10天、第20天和第30天稱量各試驗(yàn)小鼠體重并記錄。

1.6 臟器系數(shù)測(cè)定 攻毒第10天、20天、30天時(shí)，每組隨機(jī)選取10只小鼠，迅速分離心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、大腦、小腦，用剪刀小心剔除附著的脂肪和筋膜，沖洗并用濾紙吸去表面血液或體液后立即稱重，按公式計(jì)算臟器系數(shù)(%)=(臟器重量/體重)×100%。

1.7 血液生化指標(biāo)測(cè)定 在攻毒后第10天、20天、30天每組隨機(jī)取10只小鼠，采集血液后4 000 r/min離心10 min，收集血清，重復(fù)3次。按各試劑盒說明書操作，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定烏頭堿對(duì)ALT、AST活性及BUN、CRE、TC、TG、TP、ALB、GLU含量的影響。

1.8 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小顯著極差法Duncan分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠臨床癥狀及體重變化

2.1.1 臨床癥狀 對(duì)照組未見明顯異常。攻毒前10 d，低劑量組無明顯異常，中劑量組少量發(fā)汗，精神沉郁，高劑量組精神極度沉郁，發(fā)汗明顯，被毛粗亂，抱團(tuán)，震顫，輕度腹瀉。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，上述癥狀加重，雌性比雄性小鼠臨床癥狀明顯。攻毒后10 d，高劑量組出現(xiàn)明顯神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為間歇性躁動(dòng)不安，頭頸和四肢神經(jīng)性震顫，共濟(jì)失調(diào)，轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)等。尾尖發(fā)涼，四肢及鼻唇顏色發(fā)黑。

2.1.2 體重變化 由圖1可以看出，各試驗(yàn)組小鼠平均體重增長(zhǎng)趨勢(shì)低于對(duì)照組，第10天時(shí)，各試驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，第20天和第30天，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異均不顯著，高劑量組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。

圖1 亞急性烏頭堿中毒小鼠體重的變化

* ： 差異顯著(P<0.05)

2.2 臟器系數(shù)變化 由表1可以看出，與對(duì)照組相比，攻毒期間各攻毒組小鼠心臟、腎臟絕對(duì)重量增加，而臟器系數(shù)無顯著性變化。各攻毒組肝臟絕對(duì)重量先增加后降低，高劑量組變化最明顯。且隨著時(shí)間的增加，同一劑量組的臟器絕對(duì)重量呈現(xiàn)持續(xù)增加，持續(xù)減少或者先增加后減少等趨勢(shì)。攻毒第20天，高劑量組肝臟臟器系數(shù)顯著降低，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。攻毒第30天，高劑量組肝臟臟器系數(shù)降低，與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。脾臟臟器系數(shù)顯著降低，攻毒第30天，高劑量組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。肺臟臟器系數(shù)隨攻毒濃度和時(shí)間的增加而增大，且攻毒第30天，高劑量組肺臟臟器系數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。大腦臟器系數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低，攻毒第30天，高劑量組大腦臟器系數(shù)有顯著性差異(P<0.05)。小腦臟器系數(shù)有增加趨勢(shì)。

表1 亞急性烏頭堿中毒小鼠臟器系數(shù)的變化 (%，n=10)

2.3 小鼠血清生化指標(biāo)的變化

2.3.1 ALT活性的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組ALT活性無明顯變化，低劑量組、中劑量組、高劑量組活性持續(xù)升高。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別升高5.40%、11.19%、25.10%。除低劑量組外，其余兩組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別升高14.59%、27.76%、43.09%，除低劑量組外，其余2組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第30天，試驗(yàn)組分別升高20.52%、39.29%、61.91%，與對(duì)照組比較，低劑量組差異顯著(P<0.05)，中劑量組和高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

2.3.2 AST活性的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組AST活性無明顯變化，低劑量組、中劑量組、高劑量組活性持續(xù)升高。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別升高3.34%、15.51%、22.56%。除低劑量組外，其余兩組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別升高15.63%、23.61%、45.24%，與對(duì)照組比較差異均極顯著(P<0.01)；攻毒第30天，試驗(yàn)組分別升高21.18%、35.23%、58.51%，與對(duì)照組比較差異均極顯著(P<0.01)。

2.3.3 BUN含量的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組BUN含量無明顯變化，低劑量組、中劑量組、高劑量組活性持續(xù)升高。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別升高6.49%、11.32%、18.74%。低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05),高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別升高9.74%、17.42%、34.64%，除低劑量組外，其余2組與對(duì)照組比較差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；攻毒第30天，試驗(yàn)組分別升高12.89%、20.33%、48.28%，與對(duì)照組比較，低劑量組差異顯著(P<0.05)，中劑量組和高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

2.3.4 CRE含量的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，低劑量組CRE含量先降低后升高，而中劑量組和高劑量組持續(xù)升高。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組降低3.82%，中劑量組、高劑量組分別升高4.27%、11.91%，與對(duì)照組比較差異均不顯著(P>0.05)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別升高3.99%、25.78%、38.18%，除低劑量組外，其余2組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第30天，試驗(yàn)組分別升高22.36%、42.45%、63.90%，與對(duì)照組比較差異均極顯著(P<0.01)。

2.3.5 TC含量的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，各攻毒組TC含量持續(xù)升高。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別升高0.78%、12.16%、23.14%，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)高劑量組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別升高5.34%、13.88%、37.37%，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第30天，試驗(yàn)組分別升高15.58%、30.07%、54.35%，低劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，中劑量組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)，高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。

2.3.6 TG含量的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，低劑量組TG含量先降低后升高，中劑量組，高劑量組持續(xù)升高。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組組降低2.63%，中劑量組、高劑量組分別升高6.84%、22.11%，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異均不顯著(P>0.05)，高劑量組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別升高5.26%、29.19%、63.64%，低劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，中劑量組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第30天，試驗(yàn)組分別升高16.49%、72.87%、130.32%，除低劑量組外，其他兩組與對(duì)照組比較差異均極顯著(P<0.01)。

2.3.7 TP含量的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，各攻毒組TP含量持續(xù)降低。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別降低1.04%、4.21%、12.50%，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別降低5.46%、10.89%、22.92%，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第30天，試驗(yàn)組分別降低11.53%、19.23%、34.50%，與對(duì)照組比較差異均極顯著(P<0.01)。

2.3.8 ALB含量的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，各攻毒組ALB含量持續(xù)降低。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別降低2.83%、12.99%、19.66%，低劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，中劑量組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別降低4.74%、18.34%、29.06%，低劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，中劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第30天，攻毒組分別降低12.25%、28.12%、42.56%，與對(duì)照組比較差異均極顯著(P<0.01)。

2.3.9 GLU含量的變化 由表2可以看出，在整個(gè)試驗(yàn)期間，各攻毒組GLU含量持續(xù)升高。與對(duì)照組相比，攻毒第10天，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別升高0.86%、3.58%、14.47%，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第20天，各試驗(yàn)組分別升高5.41%、11.11%、18.66%，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)；攻毒第30天，試驗(yàn)組分別升高9.37%、24.50%、33.86%，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)高劑量組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

在亞急性毒性試驗(yàn)中，動(dòng)物的臟器受到毒物的毒害作用后，會(huì)發(fā)生病理性改變，往往通過臟器重量來反應(yīng)。在毒性試驗(yàn)中，動(dòng)物體重增長(zhǎng)緩慢甚至負(fù)增長(zhǎng)是常見的，體重變化幅度有時(shí)候比臟器重量變化幅度大很多，這時(shí)不會(huì)出現(xiàn)顯著性差異。當(dāng)臟器出現(xiàn)水腫、出血、充血、積水、增生、肥大等病變時(shí)，臟器重量可能會(huì)增加。當(dāng)臟器出現(xiàn)脫水、萎縮、壞死等病變時(shí)，臟器重量可能會(huì)減輕。與對(duì)照組相比，攻毒期間各攻毒組小鼠心臟、腎臟，臟器系數(shù)無顯著性變化，肝臟、脾臟，大腦臟器系數(shù)顯著下降，肺臟，小腦臟器系數(shù)增加，表明肝臟，腦等臟器出現(xiàn)了病理性改變。

肝臟是外源性毒物的主要靶器官之一。衡量肝臟功能是否正常的的主要指標(biāo)是ALT和AST，當(dāng)肝臟損傷時(shí)血清ALT和AST活性會(huì)顯著升高，故測(cè)定ALT與AST有助于判斷機(jī)體肝細(xì)胞損害程度。此外，TG和TC含量的測(cè)定也有助于評(píng)價(jià)外源性毒物對(duì)動(dòng)物機(jī)體肝臟的損傷程度[8]。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨攻毒時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加，ALT、AST活性升高，TG和TC含量增加，且具有明顯時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系，表明亞急性烏頭堿中毒可引起小鼠不同程度的肝臟損傷。

表2 亞急性烏頭堿中毒小鼠血液主要生化指標(biāo)的變化 (n=10)

腎臟是外源性毒物的主要排泄途徑，腎臟功能障礙時(shí)血清CRE和BUN含量升高，因此可以通過檢測(cè)血清CRE和BUN含量可用來反映腎小球?yàn)V過功能[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加，血清CRE，BUN含量總體呈升高趨勢(shì)，表明烏頭堿能引起小鼠腎臟功能性損害。

此外，動(dòng)物烏頭中毒其消化系統(tǒng)主要表現(xiàn)為惡心，嘔吐，腹痛，腸鳴，腹瀉，嚴(yán)重著可出現(xiàn)大小便失禁，而循環(huán)系統(tǒng)表現(xiàn)為唇青、肢冷或大汗淋漓等[7]。在本試驗(yàn)中，高劑量組小鼠表現(xiàn)大量出汗和腹瀉癥狀，表明高劑量烏頭堿可引起小鼠全身多系統(tǒng)器官的功能障礙。