高效液相色譜法測定麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿含量的方法研究

侯麗麗,王 成,武晉孝 ,林桃桃,郭 禹,劉 星

(1.山西省飼料獸藥監察所，山西 太原 030027；2.山西鑫華澤藥業有限公司，山西 晉中 030900 )

麻杏石甘口服液收載于《獸藥質量標準》2017版中藥卷，處方由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草組成，具有清熱，宣肺，平喘功能，主治肺熱咳喘[1]，處方中麻黃為君藥。麻黃為麻黃科植物草麻黃(Ephedra sinicd Stapf)木賊麻黃或中麻黃的干燥草質莖。秋季采割綠色的草質莖，曬干。麻黃是特產于中國而聞名于世界的藥用植物，具有興奮中樞神經，誘發出汗，抗過敏、抗流感病毒、利尿等作用，在中醫藥、蒙醫藥、西醫藥中都有廣泛的應用。麻黃主要成分為生物堿(1%～2%),總生物堿的80%～85%為麻黃堿(左旋麻黃堿，L-ephedrine)；其次為偽麻黃堿(D-pseudo-ephedrine)等。鹽酸麻黃堿為白色針狀結晶或結晶性粉末，是麻黃堿的鹽酸鹽。鹽酸麻黃堿也為制造冰毒的重要原料，已被納入易制毒化學品管理，麻黃堿是中藥麻黃的有效成分，也可合成，中毒大多由于過量麻黃堿或麻黃所致，麻黃堿中毒癥狀的發生主要由于中樞神經系統興奮和周圍的擬腎上腺素作用所引起。麻杏石甘口服液標準中無鹽酸麻黃堿的含量測定項，為了更好控制本品質量，本試驗對麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿的含量測定方法進行了研究。

1 儀器和材料

Agilent 1260高效液相色譜系統，鹽酸麻黃堿對照品，批號171241-201508，純度99.8%，購自中國獸醫藥品監察所。麻杏石甘口服液(批號201805066)，陰性樣品缺麻黃的麻杏石甘口服液(批號201805066)，250 mL/瓶，均由保定冀中藥業有限公司提供。乙腈為色譜級，磷酸、三乙胺、鹽酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜條件 根據參考文獻[1]方法,色譜柱為 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97)，檢測波長為207 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品10 mg，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得(每毫升含鹽酸麻黃堿20 μg的溶液)。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品1 mL，置50 mL 量瓶中，加濃氨溶液1 mL，用三氯甲烷定容至刻度，精密稱重，超聲20 min，放冷，用三氯甲烷補足減失的重量，振搖，過濾，取續濾液25 mL，加入鹽酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，殘渣加0.1 mol/L 的鹽酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加濃氨溶液1 mL，用三氯甲烷定容至刻度，精密稱重，超聲20 min，放冷，用三氯甲烷補足減失的重量，振搖，過濾，取續濾液25 mL，加入鹽酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，殘渣加0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.5 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.6 系統適用性試驗 取供試品溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，結果表明：鹽酸麻黃堿與相鄰峰達到基線分離，分離度達到4.22，鹽酸麻黃堿峰保留時間為19.5 min，理論板數為22 381，峰面積為183.1，峰寬0.30 min。試驗證實，該方法系統適用性良好，見圖1。

2.7 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進行測定，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置出相同的峰，陰性樣品在與對照品色譜峰相應的位置上，無吸收峰，說明處方中其他成分不影響鹽酸麻黃堿的含量測定，結果見圖1～3。

2.8 線性關系試驗 取鹽酸麻黃堿對照品適量，精密稱定，加0.1 mol/L的鹽酸溶液制成1 mL含鹽酸麻黃堿60 μg的溶液，即得對照品儲備液。分別取儲備液適量制成60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL鹽酸麻黃堿對照品溶液，濾過，取續濾液，分別按上述色譜條件進樣10 μL，測定峰面積。結果見表1。

圖1 鹽酸麻黃堿對照品HPLC色譜圖

圖2 麻杏石甘口服液樣品HPLC色譜圖

圖3 麻杏石甘口服液陰性樣品HPLC色譜圖

表1 線性試驗數據

以峰面積為縱坐標，鹽酸麻黃堿含量(X-mg/mL)為橫坐標作線性回歸，回歸方程為：y=23.286x + 11.931，R2= 0.999 9，結果表明，鹽酸麻黃堿在0.005～0.06 mg/mL(0.05～0.6 μg)范圍內，峰面積與鹽酸麻黃堿含量呈良好的線性關系。見圖4。

圖4 鹽酸麻黃堿線性關系

2.9 精密度試驗

2.9.1 儀器精密度試驗 精密吸取20 μg/mL的鹽酸麻黃堿對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進行測定，連續測定6次，測定峰面積，結果見表2。峰面積RSD為0.34%，結果表明精密度符合規定。

表2 精密度試驗數據

2.9.2 重復性試驗 取同一批供試品樣品，按供試品溶液制備項制備樣品溶液，制備6份供試品溶液，各取10 μL注入色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進行測定，結果見表3。鹽酸麻黃堿含量RSD為 0.87%，表明重復性好。

表3 重復性試驗數據

2.9.3 溶液穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣10 μL，記錄色譜圖和鹽酸麻黃堿峰面積，結果見表4。供試品12 h內峰面積RSD為1.06%，表明樣品在12 h內穩定。

表4 溶液穩定性試驗數據

2.9.4 加樣回收率試驗 (1)對照品溶液制備：取鹽酸麻黃堿對照品適量，精密稱定，加0.1 mol/L的鹽酸溶液制成每1 mL含鹽酸麻黃堿300 μg的溶液，即得對照品溶液。(2)加樣回收樣品溶液制備：精密量取已知含量(0.38 mg/mL)的同一批麻杏石甘口服液樣品0.5 mL，置50 mL量瓶中，加上述對照品溶液0.6 mL，加濃氨溶液1 mL，加三氯甲烷定容至刻度，精密稱重，超聲20 min，放冷，用三氯甲烷補足減失的重量，振搖，過濾，取續濾液25 mL，加入鹽酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，殘渣加0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得。

照上述供試品方法制備6份供試品溶液，取10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，計算加樣回收率。

回收率=(加對照品后測得的含量-加對照品前的含量)/實際所加對照品量×100%。結果見表5,6份樣品鹽酸麻黃堿的平均回收率為100.22%，RSD為1.47%。

2.10 耐用性試驗 取同一批供試品，改變流動相溶液比例(乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)的比例分別為1∶99、5∶95)進行測定；改變檢測波長(205 nm，209 nm)進行測定；改變柱溫(28 ℃，32 ℃)進行測定；分別用Thermo scientific BDS HYPERSIL C18 (5 μm，4.6 mm×250mm)，Syncroni AQ C18(5 μm，4.6×150 mm)，Agilent XDB C18(5 μm，4.6×250 mm)3種不同的色譜柱進行測定。

表5 加樣回收率試驗結果

結果同一供試品改變流動相比例后，RSD為0.77%；同一供試品在3個波長下，RSD為0.51%。同一供試品在改變柱溫的條件下，RSD為0.46%。同一供試品在更換不同色譜柱下進行測定，RSD為0.66%。表明儀器條件微小變動對測定結果無明顯影響。

2.11 樣品含量測定 為了充分考慮不同批次產品的含量差異，測定了19個不同批次樣品，結果見表6。鹽酸麻黃堿的含量在0.10～0.88mg/mL之間。

表6 19批樣品含量測定結果

4 討論

目前，高效液相色譜法測定鹽酸麻黃堿含量的流動相主要有甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液系列，《中華人民共和國獸藥典》2015版二部，以甲醇0.092%磷酸溶液(含0.04%三乙胺和0.02%二正丁醇)(1.5∶98.5)為流動相測定鹽酸麻黃堿的含量[2]，麻杏石甘注射液測定鹽酸麻黃堿含量[1]用流動相乙腈-0.1%磷酸(5∶95)采用其測定麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿時發現無法與供試品溶液中其他組分實現有效分離，最終根據參考文獻[1-3],以乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3 ∶97)為流動相實現了鹽酸麻黃堿的良好分離。

供試品溶液制備時比較直接定容與超聲定容提取法的效果，結果表明，超聲提取更好，采用超聲提取方法，分別超聲處理15、20、30 min，測定鹽酸麻黃堿的含量，結果表明，超聲處理20 min與超聲處理則無明顯差異，故超聲處理時間定為20 min。

本試驗建立麻杏石甘口服液中鹽酸麻黃堿的 HPLC含量測定方法，簡便、準確度高、重復性好，為麻杏石甘口服液質量控制提供了科學依據。