歸芎益母散治療奶牛血瘀型胎衣不下的擴大臨床試驗研究

黃雪利,王勝義,王 磊,王 慧,崔東安

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省中獸藥工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730050；2.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

中獸藥新藥具有“源于臨床，應用于臨床”的特點，臨床始終是中獸藥新藥研發的核心環節[1]。中獸藥新藥臨床試驗以研究藥物的臨床價值為目標。其中，擴大臨床試驗是在實驗性臨床試驗的基礎上，以陽性對照藥物為參照，通過開展多中心臨床試驗，進一步確證臨床療效。其目的是提供藥物注冊申請獲得批準的循證證據基礎，也是支持藥物上市的關鍵性研究[2]。歸芎益母散是針對奶牛胎衣不下血瘀證的病癥特點研制的中獸藥新藥，由益母草、當歸、川芎、紅花、香附和甘草等中藥組成。前期臨床試驗表明，歸芎益母散可有效治療奶牛胎衣不下，治愈率達85.9%[3]。靶動物安全性試驗表明，臨床應用歸芎益母散不建議超過1 200 g/頭，推薦有效劑量400 g/頭治療奶牛胎衣不下的安全性、耐受性好[4]。本試驗參考《奶牛繁育性能的干預研究報告建議》[5]和《草藥隨機對照臨床試驗的報告：CONSORT》申明細則[6]的要求，以促進滯留胎衣排出為主要療效評價指標，以繼發子宮炎感染率和繁殖性能為次要療效評價指標，開展隨機對照臨床試驗研究，綜合評價歸芎益母散治療奶牛胎衣不下的有效性和安全性，為新藥注冊申請和上市提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物 歸芎益母散，400 g/袋，由益母草、當歸、川芎、三棱、莪術、紅花、香附、干姜、甘草組成，由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所提供(委托北京康牧生物科技有限公司生產)，有效期2年。益母生化散，250 g/袋，由華秦源(北京)動物藥業有限公司生產，獸藥字(2012)010385148，有效期2年。經甘肅省獸藥監察所檢驗符合規定。

1.2 試驗動物 血瘀型胎衣不下奶牛。

1.3 方法

1.3.1 試驗時間與地點 于2015年11月-2017年10月，在陜西和甘肅區域的規模化牧場進行，納入牧場存欄量均在2 500頭以上，荷斯坦奶牛。

1.3.2 動物的飼養與管理 舍飼飼養，牛舍建有運動場。按照高產、中產、低產以及干奶期分群，每個圈舍按20%頸夾富余率調整牛群數量，并根據營養需要飼喂不同的全混合日糧，每日飼喂3次，自由采食、飲水。產前管理均是在預產期前1周將待產奶牛轉入產房，并以產犢母牛“自娩為主，助產為輔”的接產原則。試驗期間，在產房觀察產犢奶牛的胎衣排出情況，診斷為胎衣不下的奶牛，轉入病房，按照研究確定的診斷標準、納入標準和排除標準，經確診為氣血凝滯型胎衣不下奶牛，隨機分組，進行治療觀察，痊愈后，轉入大群。

1.3.3 動物選擇

1.3.3.1 診斷標準 具備主要指征，兼有2項次要指征，即確診為血瘀型胎衣不下[7]。(1)主要指征：產后12 h內胎衣不能完全排出。(2)次要指征：① 腹痛；② 惡露黯紅；③ 口色青紫；④ 脈象沉弦。

1.3.3.2 納入標準 年齡3-5歲，2～4胎次，體況評分[8]在2.5～4.0之間：無傳染病史，產前健康；產程順利，自然分娩，產前產后均無并發癥。

1.3.3.3 剔除標準 流產、雙胎、死胎、產后癱瘓、產后臨床型乳房炎、真胃移位、產后發熱(直腸體溫≥40 ℃)、產后腹瀉患牛以及接受與本研究無關的其他抗炎或抗生素治療措施或前期參加過其他臨床試驗的奶牛均排除于本研究。

1.3.4 分組與處理 按照診斷標準、納入標準和剔除標準，將納入的193頭患牛隨機分配到兩組，其中藥物對照組(96頭)和歸芎益母散組(97頭)。確診后(產后13±1 h)，給藥治療。于給藥前，將受試藥物用20～25 L開水浸泡30 min，候溫，經口灌服，每天1次，連用1-3 d。連續用藥3 d無效病例，可根據牧場產后常規治療程序進行施治，但必須詳細記錄在病例記錄表中。

1.4 檢測指標

1.4.1 臨床癥狀

1.4.1.1 一般臨床體征 于給藥后，監測受試奶牛的精神狀態、采食反芻以及二便情況。

1.4.1.2 滯留胎衣排出情況 試驗期間由1名試驗參與人專門負責監測滯留胎衣排出情況(每2 h目視觀察1次)，于首次給藥后72 h直腸檢測確認子宮狀態和胎衣排出情況。并記錄受試奶牛的治療時間、滯留胎衣排出時間、排出狀態等，用以評價歸芎益母散促進滯留胎衣排出的近期干預效應。

1.4.1.3 產褥期子宮炎發生情況 按照Sheldon等[9]建立的標準診斷產褥期子宮炎：產后21 d內，子宮增大，有惡露，排出紅棕色水樣分泌物；伴有全身癥狀；產奶量降低，精神沉郁，或有毒血癥，體溫升高>39.5 ℃。以產后21 d內是否繼發感染子宮炎評價歸芎益母散對受試奶牛繼發感染產褥期子宮炎的風險的中期干預效應。

1.4.1.4 繁育性能 所有受試奶牛按照牧場既定的繁育管理程序進行發情監測和配種。試驗期間，收集試驗牧場繁育配種數據，試驗期間，監測并記錄受試奶牛的分娩時間、產后首次配種時間、配種次數以及受胎時間，以評價歸芎益母散對受試奶牛繁育性能的長期干預效應。

1.5 療效評價指標及評價標準

1.5.1 主要療效評價指標 以促進滯留胎衣排出為主要評價指標，主要包括首次給藥72 h內滯留胎衣排出率、給藥次數、一次給藥滯留胎衣排出率以及滯留胎衣完全排出歷時平均時間。各指標計算公式如下：

(1)首次給藥72 h胎衣排出率(%)=

(2)滯留胎衣排出歷時平均時間=

(4)一次給藥滯留胎衣排出率(%)=

1.5.2 次要療效評價指標 以產后21 d內子宮炎繼發感染率和產后180 d內繁育性能為次要療效評價指標。其中，繁殖性能指標包括產后首次配種時間、首次配種懷孕率、配種次數、空懷時間以及產后180 d內總懷孕率。

1.6 數據統計 應用SPSS(Version21.0)軟件進行數據分析。單因素方差分析或Kruskal-Wallis評價兩組中受試奶牛的基線特點，主要包括年齡、胎次、體況評分以及兩組受試奶牛的胎衣滯留時間(用藥時間)、給藥次數、滯留胎衣排出歷時平均時間及配種次數等差異性。卡方檢驗分析評價兩組受試奶牛的首次給藥72 h內滯留胎衣排出率、一次給藥滯留胎衣排出率、首次配種懷孕率以及產后180 d內懷孕率的差異性。以滯留胎衣是否排出為協變量，采用邏輯回歸分析評價兩組產褥期子宮炎繼發感染率的差異性。以產褥期子宮炎繼發感染率、胎次、配種次數及體況評分作為協變量，利用Cox比例風險回歸分析產后至首次發情時間及空懷時間的差異性[10]。如果在產后180 d未懷孕或配種次數超過6次的受試母牛，則作為截尾數據。所有統計檢驗均采取雙側檢驗，P<0.05即認為所檢驗的差別有統計學意義。

2 結果

2.1 納入動物基線分析 2組中納入研究的胎衣不下牛在胎衣滯留時間、體況評分、平均年齡、平均胎次和雙胎率之間無顯著差異，2組基線資料具有可比性，見表1。

表1 兩組所納入胎衣不下牛的基線資料

2.2 歸芎益母散的臨床治療效果

2.2.1 主要療效評價結果 與陽性對照藥物組比較，歸芎益母散組中受試奶牛的首次給藥72 h內滯留胎衣排出率極顯著提高(P<0.01)，給藥次數顯著降低(P<0.05)，一次給藥滯留胎衣排出率顯著提高(P<0.05)，結果見表2。結果表明，歸芎益母散可有效促進滯留胎衣及早完全排出。

表2 歸芎益母散促進滯留胎衣排出的治療效果

同行數據肩注小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，下表同

2.2.2 次要療效評價結果

2.2.2.1 歸芎益母散降低胎衣不下奶牛產褥期子宮炎繼發感染率 產后21 d內，在歸芎益母散組中，15頭受試奶牛繼發感染子宮炎，發生率為15.5%，而陽性藥物對照組中，23頭受試奶牛繼發感染子宮炎，發生率為24.0%，2組比較差異極顯著(P<0.01)。結果表明，歸芎益母散可有效降低胎衣不下奶牛繼發感染產褥期子宮炎風險。

2.2.2.2 歸芎益母散提高受試奶牛產后180 d內繁育性能 與陽性藥物對照組比較，歸芎益母散組受試奶牛產后首次配種時間提前，首次配種懷孕率提高，配種次數降低，產后180 d懷孕率提高，空懷時間縮短，2組比較差異極顯著(P<0.01)，結果見表3。結果表明，歸芎益母散治療可改善胎衣不下患牛的繁育性能。

表3 歸芎益母散對受試奶牛產后180 d內繁育性能的影響

3 討論

3.1 歸芎益母散促進滯留胎衣排出的臨床效果 胎衣滯留是奶牛胎衣不下的主要病證特點，促進滯留胎衣的及早排出,反映了藥物作用于機體的治療效應。本試驗中，歸芎益母散組中受試奶牛的滯留胎衣排出率顯著提高，同時，給藥次數減少，一次給藥滯留胎衣排出率升高，其效果優于陽性對照藥物,表明歸芎益母散促進滯留胎衣排出的療效確切。目前的觀點認為,奶牛產后一旦發生胎衣不下，治療或處理不及情況下，胎衣一般會滯留7 d左右[11]。本試驗中，經歸芎益母散和益母生化散治療后，患牛的滯留胎衣排出歷時平均時間分別為(22.8±19.8)h和(26.0±16.8)h。因此，中獸藥療法治療奶牛胎衣不下具有臨床優勢。Meta分析表明，中獸藥活血化瘀療法是治療奶牛胎衣不下的有效治則[12]。歸芎益母散具有活血祛瘀，行氣止痛的功效，其治療效應與方劑配伍呈相關性。益母草具有養血活血、利尿消腫功能，《本草綱目》謂其能治胎漏、產難，胎衣不下。當歸-川芎是中獸醫經典活血化瘀藥材，其中桃紅四物湯、生化湯、當歸芍藥散等活血化瘀方劑均含歸芎藥材[13]。現代藥理研究表明，益母草中益母草堿[14]，紅花中羥基紅花黃色素A[15]，可改善子宮血液流變學及微循環障礙，調節子宮節律性收縮，加速子宮內滯留胎衣及分泌物排出。由當歸、川芎藥對配伍組成的佛手散可提升血清、子宮及胎盤組織中的TNF-α水平，而TNF-α可通過前列腺素調節子宮收縮[16]。此外，方中甘草含有有效成分查耳酮類黃酮，可通過抗炎、抗氧化作用提高機體的免疫功能[17]。因此，歸芎益母散不僅可有效解除奶牛胎衣不下的血瘀狀態，而且具有調節患牛的子宮收縮和整體免疫機能的潛在藥理效應，故能促進滯留胎衣及早排出。

3.2 歸芎益母散降低胎衣不下患牛繼發感染產褥期子宮炎 產后子宮活動力強弱與產褥期子宮炎的發生有著直接關系，如果產后子宮收縮力強，則利于胎衣和惡露排出，如果產后子宮收縮無力，加上產后胎膜滯留和溫度條件，利于細菌滋生，繼發感染子宮炎的風險高。Sandals等[18]的研究表明，54.8%的胎衣不下牛會繼發感染子宮炎或子宮內膜炎。本試驗中，歸芎益母散有效降低了產褥期子宮炎發生率，繼發感染率為15.5%。滯留胎衣及早排出改善了患牛的子宮內環境，這是歸芎益母散降低受試奶牛繼發感染產褥期子宮炎的主要有益因素。同時，方中益母草、當歸、川芎、紅花等可調節子宮收縮，加速子宮內殘留蛻膜及分泌物排出，促進產后子宮復舊[15,19-21]。益母草生物堿具有明顯的抗炎和抗內毒素作用[22]。歸芎益母散含有大劑量益母草。王夢遠等[23]發現，由益母草、川芎、當歸、甘草、五靈脂等組成的宮炎凈中總生物堿可有效抑制子宮內膜炎主要致病菌。因此，歸芎益母散降低血瘀型胎衣不下患牛繼發感染產褥期子宮炎與其改善子宮內環境以及潛在的抗炎作用相關。

3.3 歸芎益母散對胎衣不下患牛產后繁育性能的影響 胎衣不下繼發感染產褥期子宮炎，常會導致患牛子宮內膜復舊遲緩，并可引起卵巢病變(如卵泡發育異常)，導致繁殖機能恢復緩慢，甚則引發不孕[24]。因此，奶牛胎衣不下防治的終極目標是提高患牛繁殖性能。本試驗中，經歸芎益母散治療后，受試奶牛產后首次配種時間提前，首次配種懷孕率提高，空懷時間縮短，表明歸芎益母散能夠有效改善患牛繁育性能。Kiracofe[25]認為改善子宮內環境，可促進產后子宮生理功能的恢復，使得母牛達到其最佳的繁殖性能。歸芎益母散治療不僅有效促進滯留胎衣的及早排出，而且可降低產褥期子宮炎的發生風險，為胎衣不下患牛產后子宮復舊提供了理想內環境。Kindahl[26]等研究發現，子宮復舊的時間、程度與卵巢機能活動關系密切，產后子宮和卵巢機能狀態直接影響到母牛的繁殖性能。現代藥理研究表明，多種中藥對產后卵巢機能恢復具有促進作用。益母草堿可增強米非司酮和米索前列醇誘導流產大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸內分泌功能，并從轉錄水平上調E2受體mRNA 的表達，E2水平，進而促進子宮內膜的修復[27]。禹良艷等[28]發現，當歸-川芎藥對通過促進大鼠卵巢顆粒細胞增殖，調節卵巢功能。因此，可以推測歸芎益母散的治療效果，可能與其改善子宮內微環境，促進子宮內膜復舊和提高卵巢機能有關。同時，配種次數減少和空懷時間的有效縮短，不僅有效提高了奶牛的繁殖性能，而且減少了牛場直接或間接的費用支出，提高牧場收益。

4 結論

以推薦有效劑量歸芎益母散(400 g/頭)治療奶牛血瘀型胎衣不下，可有效促進滯留胎衣排出，降低子宮疾病的發生率，并能有效改善受試母牛產后繁殖性能，療效確切，安全性好。