新型非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的建立

蘇曉鷗，陳 靜，戚新明，周向梅,喬俊文，任 進

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.中國科學院上海藥物研究所,上海 浦東 201203)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 是以肝細胞脂肪變性、氣球樣變、肝小葉炎癥，可伴有肝細胞或肝竇周圍纖維化為病理特征的肝臟慢性炎性疾病，與肥胖、胰島素抵抗、高脂血癥等代謝紊亂關系密切，也是由單純性脂肪肝發展至肝纖維化、肝硬化和肝癌的重要階段[1]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，我國NASH近些年發病率明顯增加，但目前尚沒有批準的NASH治療方法。

在NASH研究和治療領域，盡管已存在諸多動物模型，但還沒有能完全復制人NASH疾病特征的動物模型。已有一些基于不同遺傳背景或飲食控制的動物模型被開發出來，但多數模型沒有展現出與人NASH相似的典型病變特征，如沒有體重增加或肥胖、肝臟組織病理學特征不符、沒有胰島素抵抗或未見脂質代謝異常等。另外，其他動物種屬從斑馬魚、果蠅到奧沙巴豬[2]，有報道被用于NASH研究，但由于飼養和管理方面的困難，限制了它們在動物模型方面的廣泛應用。因此，適用于實驗室研究且與人類NASH高度相似的新型NASH動物模型的開發，對于NASH機制研究和治療具有十分重要的意義。本試驗將建立一種新型高脂高糖飲食誘導的肝臟特異性Dicer1基因敲除C57BL/6小鼠NASH模型。

1 試驗材料

1.1 實驗動物 本試驗實驗動物由Dicer1loxp小鼠與Alb-Cre啟動子驅動的Cre重組酶轉基因小鼠雜交獲得肝臟特異性Dicer1基因敲除C57BL/6小鼠，由中國科學院上海藥物研究所分子毒理實驗室動物房自繁自養。種鼠由軍事醫學科學院王以政研究員惠贈。本試驗所用動物為6-8周齡的肝臟特異性Dicer1基因敲除C57BL/6小鼠(下文簡稱KO小鼠)，對照組為同周齡段的C57BL/6野生型小鼠(下文簡稱WT小鼠)。小鼠自由采食、飲水，照明/黑暗12 h循環。本試驗符合實驗動物管理規范。

1.2 主要試劑 總RNA提取試劑RNAiso，TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司；防RNA降解試劑RNAlater，QIAGEN公司；Primescript RT Reagent Kit(逆轉錄試劑盒)，寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Premix ExTaqTM(實時熒光定量PCR試劑盒)，TaKaRa公司，寶生物工程(大連)有限公司；天狼星紅染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；蘇木素，上海時代生物科技有限公司；油紅O 染色液，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器設備 Bio-Rad CFX ConnectTMReal-Time PCR 檢測系統(Bio-Rad 公司，美國)；HITACHI 7080全自動生化分析儀(HITACHI，日本)；脫水機(PC1501E0106，Thermo公司)；生物組織包埋機(B64110021，Thermo公司)；切片機(FN3240E1003，Thermo公司)；自動染色機(RH2062E，Thermo公司)；顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)。

2 試驗方法

2.1 動物分組和試驗設計 雄性6-8周齡KO小鼠10只，隨機分為2組；同齡雄性WT小鼠10只，隨機分為2組；共4組，每組5只，記錄實驗動物試驗初始體重，分別給予正常飲食(Normal Chow Diet)和高脂高糖飲食，12周。高脂成分為60 kcal%脂肪(每2 d更換1次)，高糖為高果糖漿(High-Fructose Corn Syrup)，成分為77.3%果糖(34 g/L)和22.7%葡萄糖(10 g/L)，按重量計算為44 g/L(隔日更換)。KO小鼠給予正常飲食組，記為CK組；KO小鼠給予高脂高糖飲食組，記為HK組，即本試驗建模組；WT小鼠給予正常飲食組，記為CW組；WT小鼠給予高脂高糖飲食組，記為HW組。

2.2 肝臟Dicer1基因表達水平檢測 (1)試驗12周后，各組小鼠安樂死，快速采集肝臟組織，液氮閃動，后轉到-80 ℃保存，用于檢測各組肝臟Dicer1基因表達水平;(2)提取肝臟總RNA，然后應用反轉錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix將總RNA反轉錄成 cDNA，實時熒光定量PCR檢測各組小鼠肝臟Dicer1基因mRNA表達量。肝臟Dicer1引物序列(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)：上游: 5′-TCAGATCACTTCCCGTGGATT-3′；下游: 5′-CAGCCAACGAGGAGTTACAGC-3′。

2.3 口服糖耐量(OGTT) 檢測 各組小鼠計劃解剖前5-7 d內，隔夜禁食約16 h，自由飲水，后口服給予1.5 g/kg·bw葡萄糖溶液，取尾靜脈血，記錄 0、15、30、45、60、90 min和120 min時間點的血糖值，根據各時間點血糖濃度曲線下面積(AUC)，計算每組AUC均值分析組間OGTT差異。

2.4 血清學檢測 計劃解剖當天，各組小鼠麻醉后采集血液于1.5 mL 離心管，4 ℃條件下離心取上清，利用生化分析儀檢測幾種血清指標，包括谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)和高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)。

2.5 組織病理學檢查 計劃剖檢當天，記錄各組動物臨終體重。各組小鼠在麻醉、采血及安樂死后，收集各組小鼠肝臟、腎周脂肪、以及附睪周圍脂肪進行稱重。然后將肝臟左葉固定于10 %中性福爾馬林緩沖液，之后進行常規組織脫水、包埋、切片，H.E.染色和天狼星紅染色；另取一部分肝臟做冰凍切片，用于油紅O 染色。對染色后的切片在顯微鏡下做組織病理學評分。主要參考NASH臨床研究網(CRN)公布的相關標準，制定了如下評分標準:肝細胞脂肪變性評分為0(<5%)、1(5%～33%)、2(33%～66%)、3(>66%)；肝細胞氣球樣變評分為0(無)、1(少數)或2(多數/明顯)；小葉炎癥評分為0(無炎癥)、1(炎性細胞主要分布在肝小葉III區)、2(炎性細胞主要分布在肝小葉III區，但II區和I區也可見炎性細胞)、3(炎性細胞彌漫至整個肝小葉)；纖維化評分為0～4分別對應F0-F4期：F0期(無纖維化)、F1a期(輕度、III區、竇周肝纖維化)、F1b期(中度、III區、竇周肝纖維化)、F1c期(門靜脈/門靜脈周圍纖維化)、F2期(竇周、門靜脈/門靜脈周圍纖維化)、F3期(橋接纖維化)和F4期(肝硬化)。

2.6 統計分析 結果以平均值±標準差的方式表示。采用Graphpad Prism 7.0軟件進行統計分析；多組比較(其他三組與HK組相比)使用One-way ANOVA分析。當P<0.05時，認為組間具有統計學差異。*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001。

3 試驗結果

3.1 各組肝臟Dicer1基因表達水平比較 肝臟Dicer1基因表達檢測結果顯示，HK組肝臟Dicer1 mRNA表達水平相比CW和HW組顯著下降；CK組未檢測到肝臟Dicer1 mRNA表達(圖1)。

3.2 OGTT測試結果 OGTT是臨床評價胰島素抵抗(IR)常用的方法。OGTT結果顯示，HK組平均OGTT AUC顯著高于CW和CK組但低于HW組；提示HW和HK組經過高脂高糖誘導后糖耐量相比正常WT小鼠(CW組)降低，且HW比HK組糖耐量降低更顯著(圖2)。提示HK和HW組存在IR。

3.3 肝損傷一般指標變化 HK組肝臟重量比重(肝重相對體重比值)與CW和HW組相比顯著升高(圖3A)。血清生化檢測結果顯示，HK組與CW和HW組相比ALT水平顯著升高；HK組AST水平相比CW、CK、HW組均升高(圖3 B、C)，表明HK組存在肝功能異常，提示肝損傷，與肝臟組織病理檢查結果一致。

3.4 血脂指標變化 HK組相比CW和HW組，甘油三酯(TG)升高(圖4A)；HK組與相比其他三組，總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)升高(圖4B、C)；提示HK組血脂異常。此外，高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)方面，各組間沒有統計學差異(圖4D)。

3.5 體重變化 在試驗第1天,各組小鼠體重未見明顯差異(圖5A)，在試驗12周時，HK組體重高于其他三組，且具有統計學意義(圖5B)；HK組在試驗的12周內體重增長也高于其他三組，且具有統計學差異(圖5C)。

3.6 附睪和腎周白色脂肪重量變化 試驗12周時，HK組腎周白色脂肪和附睪白色脂肪比重(腎周或附睪白色脂肪重量相對體重比值)，與CK和CW組相比，均顯著升高，與HW組相比未見明顯差別(圖6A，B)。

3.7 組織病理學結果 肝臟經常規病理制片和H.E.染色后，CW組未見明顯異常(中插彩版圖7A)；HW組僅見部分肝細胞空泡變(中插彩版圖7C，E)；CK組和HK組顯微鏡下可見肝細胞胞漿有大小不一空泡，以及肝小葉炎癥，HK組程度更為嚴重(中插彩版圖7B，7D，7F)；HK組肝臟還可見肝細胞氣球樣變(Hepatocellular ballooning)，個別肝細胞胞漿還可見Mallory-Denk小體 (MDB)、以及單個肝細胞凋亡。此外，CK和HK組肝臟還可見纖維化。油紅O染色證實肝細胞胞漿內的空泡為脂肪空泡(中插彩版圖7G)。天狼星紅染色進一步證實CK和HK組存在不同程度的纖維化，呈紅染的雞絲樣結構，主要分布在肝細胞或肝竇周圍(中插彩版圖7H)，HK組較CK組纖維化程度重。各組肝臟組織病理學半定量評分結果見圖8，HK組肝臟的各項病變評分均明顯高于其他三組。

圖1 各組小鼠肝臟Dicer1基因表達水平

圖2 各組小鼠口服葡萄糖耐受試驗結果

圖3 各組小鼠肝臟比重、血清ALT 、AST水平變化

圖4 各組小鼠血清TG、TC、HDLC、LDLC水平變化

圖5 各組小鼠第1天體重變化、第12周體重變化及12周內體重增長變化

圖6 各組小鼠腎周白色脂肪比重和附睪白色脂肪比重

圖8 各組小鼠肝臟組織病理學評分

A:各組肝細胞脂肪變性評分；B：各組肝臟小葉炎癥評分；C:各組肝臟肝細胞氣球樣變評分；D：各組肝臟纖維化評分

4 討論與結論

Dicer在生物體的發育形成、增殖、分化、衰老和凋亡等過程中發揮重要的作用，已有越來越多的Dicer基因敲除動物模型被運用到不同的疾病研究中。在中國科學院上海藥物研究所分子毒理組團隊的前期研究中發現小鼠肝臟特異性敲除Dicer1基因后會可自發地引起肝臟脂質蓄積，包括膽固醇、甘油三酯等[3]。

本研究通過用Dicer1loxp小鼠與Alb-Cre啟動子驅動的Cre重組酶轉基因小鼠雜交獲得肝臟特異性Dicer1基因敲除小鼠，然后用高脂高糖誘導肝臟特異性Dicer1基因敲除小鼠建立NASH動物模型，并通過與正常飲食和高脂高糖飲食的WT小鼠(CW和HW組小鼠)以及正常飲食的KO小鼠(CK組小鼠)進行對比，揭示本試驗模型(HK組小鼠)相比野生型小鼠以及正常飲食的KO小鼠在造模方面的特異性優勢。試驗結果表明，經HK組小鼠出現體重上升、附睪和腎周白色脂肪比重增高(提示肥胖)、糖耐量降低(提示胰島素抵抗)、肝功和血脂異常，與人類NSAH相關特征相似。而CK組、HW組小鼠不能完全復制人類NASH的基本特征，或未見血脂異常或沒有明顯的體征變化(體重升高、肥胖)或糖耐量正常等等。在組織病理表型方面，HK組小鼠，其組織病理特征在肝脂肪變性、肝細胞氣球樣變、肝小葉炎癥、肝纖維化、個別肝細胞胞漿內存在Mallory-Denk小體等方面與人NASH組織病理表型相似。而CK組小鼠在NASH相關病理特征方面不及高脂高糖誘導的KO小鼠明顯，也未見肝細胞的氣球樣變和Mallory-Denk小體。HW組小鼠僅表現出肝細胞脂肪變性。CW組小鼠在生理、生化、組織病理方面均正常。

上述結果表明，該模型在體重上升、白色脂肪比重增高(肥胖)、肝功異常、血脂異常、糖耐量降低、肝臟組織病理學特征等方面與人類NSAH相似[4-5]，且該模型的另一優勢是誘導周期較短，僅12周就出現較為明顯的非酒精性脂肪性肝炎癥狀，較文獻報道的大多數NASH動物模型造模時間短。此外，該模型造模所用的高脂高糖飲食成分與引起人類NASH常見的飲食結構相似，其中不含有促進肝臟脂質蓄積、纖維化的化學物質。這一模型的建立將有助于NASH疾病機制以及治療方面的研究，可進一步探索該模型在其他方面與人類NASH的相似性。