人參莖葉中原二醇型、原三醇型人參皂苷抗疲勞作用試驗(yàn)

王麗娜，姜 珊，王溪竹，李 娜，劉景圣，鄭明珠，畢云楓

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

人參(PanaxginsengC.A.Mey)是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，人參的根、莖、葉都具有獨(dú)特的藥理作用。人參皂苷是人參的主要活性物質(zhì)，人參皂苷可分為3種類型,即原人參二醇型皂苷(如人參皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd等)、原人參三醇型皂苷(如人參皂苷Rg1和Re等)和齊墩果酸(如人參皂苷Ro)[1]。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為[2]，補(bǔ)氣類藥物可用于緩解運(yùn)動性疲勞。人參，即屬于此，其機(jī)制是通過促進(jìn)肝臟中蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成及其代謝物排出，興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)而增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動耐受力，通過縮短疲勞恢復(fù)期、減少氧的消耗起到抗疲勞、耐缺氧的作用[3-5]。本研究通過小鼠負(fù)重力竭游泳試驗(yàn)，檢測與疲勞作用相關(guān)的生物化學(xué)指標(biāo)，從藥物活性有效部位群角度出發(fā)，對從人參莖葉總皂苷中分離出的PPD-Gsls和PPT-Gsls進(jìn)行抗疲勞作用研究，為充分有效利用藥物活性成分，開發(fā)人參功能性食品和藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人參莖葉總皂苷，購自吉林省宏久生物科技有限公司(人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rd的總量為45%(HPLC))；紅景天膠囊，購自吉林大藥房(國食健字G20100243)；AB-8大孔吸附樹脂,購自天津南大樹脂科技公司；SPF級昆明系雄性小鼠(體重18～22 g)，購自遼寧實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0003。飼養(yǎng)環(huán)境條件：溫度(20～25 ℃)，相對濕度(45%～55%)，并能夠自由采食、飲水。肝/肌糖原試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、全血(LD)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 游泳池自制；鉛絲，青島哈納斯環(huán)保設(shè)備有限公司；電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)，北京波恩儀器測控有限公司；溫水浴箱，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，濟(jì)南高奎醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)樣品及制備方法[6]PPD-Gsls和PPT-Gsls的制備方法：稱取40 g人參莖葉總皂苷配成水溶液進(jìn)行超聲處理后，離心取上清液。將得到的上清液定容到500 mL，加入到已處理好的AB-8大孔樹脂柱(柱床體積：直徑8 cm，柱長35 cm)上，將樣液在樹脂柱中吸附48 h后，利用不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫流速控制在12 mL/min，將人參莖葉總皂苷逐步進(jìn)行分離。得到PPT-Gsls和PPD-Gsls洗脫液后凍干得到兩種組分皂苷的固體粉末。

1.3.2 試驗(yàn)分組及周期 將80只雄性小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只。設(shè)立不同劑量的試驗(yàn)組、陽性對照組和空白對照組。試驗(yàn)組分別為PPD-Gsls低劑量組(10 mg/kg·bw·d)；PPD-Gsls中劑量組(20 mg/kg·bw·d)；PPD-Gsls高劑量組(40 mg/kg·bw·d)；PPT-Gsls低劑量組(10 mg/kg·bw·d)；PPT-Gsls中劑量組(20 mg/kg·bw·d)；PPT-Gsls高劑量組(40 mg/kg·bw·d)；所有人參皂苷組每天1次灌胃給予相應(yīng)的藥品，陽性對照組給予紅景天膠囊(0.6 g/kg·bw)，空白對照組給予同等體積的生理鹽水，按照0.1 mL/10 g體重的灌胃容積進(jìn)行灌胃，共給藥15 d。

1.3.3 小鼠力竭游泳時間和體重測定 參照《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)要求對雄性小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)[7]。空白對照組，陽性對照組和試驗(yàn)組小鼠每天上午灌胃給藥。除空白對照組外，其余組小鼠在末次給藥30 min后，放入水溫為30～32 ℃的水槽(50 cm×50 cm×60 cm)內(nèi)進(jìn)行游泳訓(xùn)練。第1天0負(fù)重，下水游30 min；第2-3天游泳時間為60 min；第4-5天游泳時間為90 min，并在以后的游泳訓(xùn)練中都穩(wěn)定在90 min這個水平上；第7-9天負(fù)重2.0%體重的鉛絲；第10-12天負(fù)重3.0%體重的鉛絲；第13-15天負(fù)重3.5%體重的鉛絲。每隔5 d測定小鼠的前期、中期及后期體重。游泳訓(xùn)練結(jié)束后，除空白對照組外，其余各組小鼠灌胃給藥，30 min后進(jìn)行力竭游泳試驗(yàn)，記錄各組小鼠力竭游泳時間。小鼠的力竭標(biāo)準(zhǔn)為：自下水游泳開始至游泳力竭(沉入水面下8 s不能上浮)的時間。

1.3.4 LDH活性測定 除空白對照組外，其余組小鼠在末次給予相應(yīng)樣品30 min后，小鼠尾部負(fù)重3.5%體重的鉛絲，進(jìn)行90 min負(fù)重游泳(水溫30～32 ℃)，從水中取出小鼠安靜15 min后，摘除眼球取血，血液離心(3 000 r/min，10 min)，血清按照試劑盒說明書方法測定LDH活性。

1.3.5 血乳酸測定 處理同1.3.4，采血后按照試劑盒方法說明書測定血乳酸。

1.3.6 肌、肝糖原測定 采血后，將小鼠脫頸處死，取小鼠后肢肌肉及肝臟，放入預(yù)冷的生理鹽水中洗去血漬，再用吸水紙吸干水漬，之后稱取后肢肌肉85 mg，肝臟75 mg，按照試劑盒說明書方法測定肌、肝糖原。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPD-Gsls和PPT-Gsls對小鼠訓(xùn)練后體重的影響 不同組的小鼠經(jīng)連續(xù)灌胃并游泳訓(xùn)練15 d后，小鼠體重的變化見表1。在訓(xùn)練后期，與空白對照組小鼠體重比較,陽性對照組小鼠體重顯著降低(P<0.05)。與陽性對照組比較，PPD-Gsls高劑量組和PPT-Gsls低劑量組小鼠體重降低，PPD-Gsls高劑量組和PPT-Gsls低劑量組具有差異顯著性(P<0.05)。其余的人參皂苷組與陽性對照組相比體重均無顯著性差異。這表明PPD-Gsls和PPT-Gsls對小鼠體重有一定的影響。

2.2 PPD-Gsls和PPT-Gsls對小鼠力竭游泳時間的影響 PPD-Gsls組和PPT-Gsls組連續(xù)給藥并游泳訓(xùn)練15 d后，對小鼠力竭游泳時間的影響結(jié)果見圖1。由圖可知，與陽性對照組比較，PPD-Gsls低劑量組和高劑量組顯著延長了小鼠的力竭游泳時間(P<0.05)，分別是陽性對照組的1.23倍和1.34倍；與陽性對照組比較，PPT-Gsls低劑量組可顯著延長小鼠的力竭游泳時間(P<0.05)，PPT-Gsls高劑量組極顯著的延長小鼠的力竭游泳時間(P<0.01)，分別是陽性對照組的1.38倍和1.62倍。這表明PPD-Gsls和PPT-Gsls的低、高劑量組均可顯著延長小鼠的力竭游泳時間。

表1 負(fù)重游泳體重的影響 s,n=10)

陽性對照組與空白對照組比較，##：P<0.01，#：P<0.05；人參皂苷組與陽性對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01

圖1 力竭游泳時間的影響

人參皂苷組與陽性對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01

2.3 PPD-Gsls和PPT-Gsls對小鼠游泳運(yùn)動后相關(guān)生化指標(biāo)的影響 PPD-Gsls和PPT-Gsls對小鼠游泳后機(jī)體內(nèi)的血乳酸含量、乳酸脫氫酶活力、肝糖原及肝糖原含量的影響，結(jié)果見表2。

2.3.1 乳酸測定結(jié)果分析 經(jīng)灌胃給予不同劑量的樣品連續(xù)游泳15 d后，與空白對照組比較，陽性對照組小鼠血清中血乳酸含量顯著升高(P<0.05)。與陽性對照組比較，PPD-Gsls各劑量組和PPT-Gsls低劑量組小鼠血清中血乳酸含量明顯降低，其中PPD-Gsls低劑量組差異極顯著(P<0.01)，PPD-Gsls中、高劑量組和PPT-Gsls低劑量組差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 乳酸脫氫酶測定結(jié)果分析 與空白對照組比較，陽性對照組小鼠血清中乳酸脫氫酶活力極顯著降低(P<0.01)。與陽性對照組比較，PPD-Gsls各劑量組和PPT-Gsls各劑量組小鼠血清中乳酸脫氫酶活力都明顯升高，PPD-Gsls各劑量組和PPT-Gsls各劑量組差異極顯著(P<0.01)。

表2 血清及肝臟相關(guān)生化指標(biāo)的影響 s,n=10)

陽性對照組與空白對照組比較，##：P<0.01，#：P<0.05；人參皂苷組與陽性對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01

2.3.3 肝糖原測定結(jié)果分析 與空白對照組比較，陽性對照組運(yùn)動疲勞小鼠肝糖原含量極顯著降低(P<0.01)。與陽性對照組比較，PPD-Gsls中、高劑量組和PPT-Gsls各劑量組提高小鼠體內(nèi)的肝糖原含量，PPD-Gsls高劑量組和PPT-Gsls低、中劑量組小鼠體內(nèi)肝糖原含量極顯著升高(P<0.01)，PPD-Gsls中劑量組和PPT-Gsls高劑量組小鼠體內(nèi)肝糖原含量顯著升高(P<0.05)。

2.3.4 肌糖原測定結(jié)果分析 與空白對照組比較，陽性對照組運(yùn)動疲勞小鼠的肌糖原含量顯著降低(P< 0.05)。與陽性對照組比較，PPD-Gsls各劑量組和PPT-Gsls各劑量組小鼠的肌糖原含量顯著升高，PPD-Gsls中劑量組和PPT-Gsls低劑量組小鼠的肌糖原含量顯著升高(P<0.05)，PPD-Gsls低、高劑量組和PPT-Gsls中、高劑量組小鼠的肌糖原含量極顯著升高(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

我國的傳統(tǒng)中藥如人參、淫羊藿及黃精等，較一些化學(xué)合成的藥物抗疲勞作用具有更安全、藥效強(qiáng)、副作用少等特性，因而被廣泛的應(yīng)用[7]。本試驗(yàn)通過小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)考察疲勞小鼠的體重、血乳酸、乳酸脫氫酶、肝糖原及肌糖原含量的各項(xiàng)指標(biāo)[8-9]來反應(yīng)機(jī)體的疲勞程度是可行的。體重主要反映訓(xùn)練的量和訓(xùn)練后的恢復(fù)狀況指標(biāo)，可作為是否訓(xùn)練過度的主要指標(biāo)之一。運(yùn)動后體內(nèi)血乳酸含量水平顯著增加，過量的血乳酸是導(dǎo)致肌肉疲勞的重要原因[10-12]。已證實(shí)人參皂苷能顯著減少乳酸堆積[13]，其原因是減少乳酸生成和加速乳酸清除等方面。乳酸脫氫酶(LDH)的活力是反映肌肉中乳酸清除的快慢。引起機(jī)體疲勞的另一個原因是肌糖原的過量消耗，肌糖原含量的增加可延緩因長時間運(yùn)動而導(dǎo)致的疲勞[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明：PPD-Gsls和PPT-Gsls均能延長小鼠的力竭游泳時間，后者作用更顯著；加速疲勞小鼠體內(nèi)的血乳酸(LD)的代謝分解，以PPD-Gsls的作用更顯著；PPD-Gsls和PPT-Gsls均能顯著提高運(yùn)動疲勞小鼠的肝、肌糖原在機(jī)體內(nèi)的含量，為運(yùn)動提供能量，減緩血液中各生化指標(biāo)含量水平的變化幅度。由數(shù)據(jù)綜合分析可知，PPD-Gsls和PPT-Gsls均具有明顯的抗疲勞作用，其中PPD-Gsls對乳酸、乳酸脫氫酶和肌糖原的作用更顯著，而PPT-Gsls對肝糖原的作用更顯著，這為有效開發(fā)利用人參莖葉，開發(fā)其藥物和功能性食品提供了理論依據(jù)。