貉源肺炎克雷伯菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

柳 佳，李永秀，李 婧，喻桂婧，潘素敏，肖佳孟，史秋梅，王秋悅

(1.河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 063000；2.唐山動物園，河北 唐山 063000；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)屬腸桿菌科、克雷伯菌屬，是腸道有莢膜的革蘭陰性桿菌，典型的人獸共患條件性致病菌[1]。該菌廣泛存在于機(jī)體消化道、呼吸道、泌尿生殖道等，常引起人畜重癥肺炎、泌尿道、膽道感染、敗血癥和化膿性腦膜炎等嚴(yán)重疾病，若治療不當(dāng)，死亡率極高[2-3]。呂媛等報(bào)道肺炎克雷伯菌能引起新生兒的敗血癥，該菌易產(chǎn)生耐藥性[4]。肺炎克雷伯菌廣泛存在環(huán)境中，能引起豬、山羊、梅花鹿、牛等多種動物發(fā)病，主要引起肺炎、腦膜炎、肝膿腫甚至和全身敗血癥等,發(fā)病率與死亡率都較高[5-6]。

隨著毛皮動物狐、貉、貂養(yǎng)殖量增加，肺炎克雷伯菌引起的狐、貉、貂發(fā)病越來越多。鐘世勛等報(bào)道，2012-2013年間，山東地區(qū)10個地市毛皮動物(狐貍、貉子、水貂)肺炎克雷伯菌感染率為37.58%[7]。肺炎克雷伯菌對毛皮動物(狐貍、貉子、水貂)的養(yǎng)殖存在潛在威脅，應(yīng)引起重視。

河北省某地區(qū)貉子養(yǎng)殖廠，貉子突然發(fā)病，臨床表現(xiàn)為精神沉郁、蜷縮，食欲不振，結(jié)膜蒼白，呼吸急促、偶見咳嗽、鼻腔有分泌物，站立不穩(wěn)，有的還出現(xiàn)了腹瀉，頭部、頸部出現(xiàn)膿包等。本試驗(yàn)對病死貉無菌采集肺臟、肝臟、淋巴結(jié)等病變組織，分離出單一菌株，采用常規(guī)鑒定方法和16S rRNA PCR方法，確定分離菌株HM-1為肺炎克雷伯菌，該菌具有致病性，并通過藥敏試驗(yàn)分析其耐藥譜，為下一步預(yù)防和控制該病流行提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 肺炎病死貉，無菌操作采集具有典型病理變化的肺臟、肝臟和脾臟等病料。

1.2 主要試劑與儀器 血平板培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯(生工生物工程(上海)股份有限公司)；瓊脂糖(香港基因有限公司)；ID32E腸道菌鑒定試條(BioMerieuxsa公司)；藥敏紙片(浙江省杭州天和微生物試劑有限公司)；2×TaqMaster Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；樹脂型TM基因組DNA提取試劑、PCR所用引物、GoldViewTM核酸染料和DM-2 000(北京賽百盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。高壓滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海瑯玕試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；PCR儀(Mastercycler gradient,德國Eppendorf公司)；雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(北京六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國SIM公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 20 g左右健康BALB/c小鼠8只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化 無菌取病死貉的肺臟、肝臟和脾臟，接種于血平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12-16 h；挑取典型的單菌落接種劃線普通培養(yǎng)基和S.S.培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌的純培養(yǎng)；純化培養(yǎng)后，提取優(yōu)勢菌落接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)，并挑取純培養(yǎng)的單菌落涂片，革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 細(xì)菌生化特性鑒定 按說明書進(jìn)行操作，用自動生化鑒定系統(tǒng)ID32E腸道菌鑒定試劑條進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.6 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定 用營養(yǎng)肉湯純培養(yǎng)細(xì)菌，按照說明書提取DNA基因組，根據(jù)細(xì)菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)的通用引物，對細(xì)菌的16S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為30 μL，包括2×TaqMaster Mix 15 μL，上下游引物各1 μL，菌液2 μL，超純水補(bǔ)足至30 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s；退火55 ℃，40 s；延伸72 ℃，1 min；35個循環(huán)；延伸72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行同源性比對分析，用DNASTAR軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行同源性分析。

1.7 動物致病性試驗(yàn) 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8]，將8只試驗(yàn)小鼠分為2組。第1組為試驗(yàn)組，每只腹腔接種的劑量為0.25 mL(107CFU/mL)菌液；第2組為空白對照組，接種等量營養(yǎng)肉湯，接種12 h后，觀察小鼠發(fā)病狀況和死亡情況，對死亡小鼠無菌采集肺臟、肝臟和脾臟,進(jìn)行分離鑒定。

1.8 藥敏試驗(yàn) 參照K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)和結(jié)果判斷[9]，在無菌條件下，用無菌棉簽蘸取菌液，均勻涂布在普通培養(yǎng)基上，用無菌鑷子取藥敏紙片，貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)12-16 h，測量藥敏紙片抑菌圈直徑并判斷其敏感性。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢 病貉臨床表現(xiàn)主要為精神沉郁、蜷縮，食欲不振，結(jié)膜蒼白，呼吸急促、偶見咳嗽、鼻腔有分泌物，站立不穩(wěn)，有的還出現(xiàn)了腹瀉，頭部、頸部出現(xiàn)膿包等；剖檢變化為上呼吸道黏膜充血水腫，肺充血、出血、氣腫；肝臟明顯腫大、質(zhì)脆硬、出血，切面外翻，流出暗紅色、凝固不良的血液；脾腫大。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察 分離菌株HM-1在血平板培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h后，可見培養(yǎng)基表面生成圓凸、光滑濕潤、半透明、粘稠的菌落，拉動呈絲線狀(見中插彩版圖1A)；在S.S.培養(yǎng)基上可見培養(yǎng)基表面生成粉紅色圓凸、濕潤的菌落(見中插彩版圖1B)；革蘭染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)存在兩端鈍圓、濃染的革蘭氏陰性粗短桿菌，呈單個、成對或短鏈狀排列(見中插彩版圖1C)。

2.3 細(xì)菌生化鑒定 采用自動ATB細(xì)菌鑒定儀，利用ID32E腸道菌鑒定試劑條進(jìn)行生化鑒定，分離菌株HM-1氧化酶陰性、過氧化氫酶陽性，發(fā)酵D-葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可以利用木糖、果糖、D-葡萄糖等作為碳源，甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)陽性、不產(chǎn)生H2S，精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、尿素酶為陰性，生化鑒定結(jié)果為肺炎克雷伯菌。與李超等[8]報(bào)道一致。

2.4 16S rRNA測序與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 利用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，得到1 500 pb左右的條帶(圖2)；將上述菌株的16S rRNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，并使用MEGA8.1對分離菌株的16S rRNA序列與其他相似性較高的種屬的16S rRNA序列進(jìn)行多序列匹配排列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株與克雷伯菌F2R9以及01A030聚為一支，相似度為最高，達(dá)到99.8%，而與其他菌株的遺傳距離較遠(yuǎn)一些，所以從系統(tǒng)發(fā)育樹和序列相似度上來看，分離到的菌株與克雷伯菌較近些(圖3)。

圖2 分離菌株HM-1 16S rRNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

M：DL-2 000 Marker；1、2、3：PCR產(chǎn)物

圖3 分離菌株HM-1 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 動物致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組的4只小鼠在接種后12 h，出現(xiàn)精神沉郁、拒食拒飲、蜷縮不動、呼吸急促，36 h出現(xiàn)了死亡，剖檢死亡的小鼠，肺部呈現(xiàn)出血、腫大，無菌采集小鼠肺臟、肝臟、脾臟等組織分離培養(yǎng)鑒定。結(jié)果顯示，所分離菌與該病病原菌HM-1一致。對照組4只小鼠健康存活，表明該菌有一定致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn) 對14種抗生素進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)(表1)，結(jié)果顯示：分離菌株HM-1僅對頭孢噻肟高度敏感；對頭孢曲松、新霉素、卡那霉素3種藥物中度敏感；對青霉素、林可霉素、氧氟沙星等10種抗生素高度耐藥。

3 討論

肺炎克雷伯菌屬包括肺炎克雷伯肺炎亞種、臭鼻亞種及鼻硬結(jié)亞種，其中肺炎克雷伯肺炎亞種分布最為廣泛，是引發(fā)動物及人呼吸道感染主要病原菌之一，是常見的條件性致病菌[10]。近年來，有關(guān)肺炎克雷伯菌引起人和動物疾病的報(bào)道在迅速增多，尤其是毛皮動物(狐貍、 貉子、 水貂)，嚴(yán)重地威脅著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果/mm

藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)RIS抑菌圈直徑結(jié)果氟苯尼考Florfenicol≤1415^18≥190R恩諾沙星Enrofloxacin≤1011^15≥160R阿莫西林Amoxicillin≤1314^17≥180R氧氟沙星Ofloxacin≤1213^15≥160R青霉素Penicillin≤1415^17≥180R氨芐西林Ampicillin≤1415^17≥180R復(fù)方新諾明Compound sulfamethoxazole≤1011^15≥160R諾氟沙星Norfloxacin≤1213^16≥170R環(huán)丙沙星Ciprofloxacin≤1213^16≥170R卡那霉素Caramycin≤1314^17≥1814I林可霉素Lincomycin≤1415^20≥210R新霉素Neomycin≤1011^15≥1612I頭孢曲松Cefatriaxone≤1415^17≥1816I頭孢噻肟Cefixime≤1415^17≥1820S

S:高度敏感；I:中度敏感；R:耐藥

本試驗(yàn)通過對送檢的肺炎病死貉，無菌采肺臟、肝臟和脾臟等病料，分離出1株菌HM-1，采用常規(guī)的分離鑒定方法和16S rRNA PCR方法，確定為肺炎克雷伯菌，致病性試驗(yàn)表明，該菌為致病菌，在分離菌的過程中，只分出單一的肺炎克雷伯菌，證實(shí)了該菌是引起貉肺炎的主要病原菌。鐘世勛等[11]報(bào)道了從肺炎病死的貉體內(nèi)分離出2株致病性肺炎克雷伯菌。該菌廣泛存在于環(huán)境中，主要通過呼吸道感染，尤其在高密度養(yǎng)殖過程中或者外界條件發(fā)生改變時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫力低下，容易發(fā)病，不易控制[12]。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：14種抗生素中，僅對頭孢噻肟高度敏感；對新霉素、頭孢曲松和卡那霉素中度敏感；對10種抗生素高度耐藥。由于近年來抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象愈加嚴(yán)重，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌可產(chǎn)生耐藥菌株。孫虎芝等[12]報(bào)道，水貂的肺炎克雷伯菌在24種藥物中，37.5%的藥物耐藥，也出現(xiàn)很強(qiáng)的耐藥性。林星宇等[13]報(bào)道了豬源肺炎克雷伯菌對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等19種常用藥物耐藥，出現(xiàn)了多重耐藥菌株。許多文獻(xiàn)報(bào)道，肺炎克雷伯菌對頭孢菌素不敏感，可能與該菌的耐藥機(jī)制有關(guān)[14]。肺炎克雷伯菌耐藥性與感染的宿主(水貂、豬、貉)不同，其敏感性也不同，也可能與地區(qū)有關(guān)系。根據(jù)肺炎克雷伯菌流行特點(diǎn)，因此當(dāng)養(yǎng)殖場發(fā)生疾病時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感藥物進(jìn)行合理的用藥，才能起到良好的治療效果。