雞白痢與雞傷寒沙門菌雙重PCR方法的建立和初步應用

朱春紅，陶志云，劉宏祥，徐文娟，章雙杰，李 非，唐燕飛，蔣蓮華

(1.江蘇省家禽科學研究所，江蘇 揚州 225125；2.廣西富鳳集團農牧有限公司，廣西 南寧 530000)

沙門菌是一種常見的人獸共患病病原，部分血清型沙門菌在家禽生產過程中的感染和污染嚴重影響家禽生產效率，危害養禽業[1-3]。雞傷寒沙門菌的兩種不同的生物型-雞白痢沙門菌(Salmonellapullorum)和雞傷寒沙門菌(Salmonellagallinarum) (簡述雞白痢和雞傷寒沙門菌),分別引起雞白痢(Pullorum disease) 和雞傷寒(Fowl typhoid)，都是雞的重要致病菌。一般情況下,雞白痢沙門菌多侵害20日齡以內幼雛,引起白色下痢,病死率極高,在成年雞僅有零星死亡,但可成為無癥狀帶菌者,帶菌母雞經卵巢垂直傳播。而雞傷寒沙門菌對雛雞、成年雞均可致病,常引起貧血、白細胞增多、出血為特征的急性膿毒敗血癥,死亡率可高達10%[5-6]。在美國和歐美國家，通過嚴格的凈化措施，基本控制雞白痢與雞傷寒對家禽生產的影響，而與西方發達國家的情況明顯不同的是，在我國以及眾多發展中國家的雞群中還普遍存在雞白痢與雞傷寒，嚴重危害養禽業的發展。

國務院頒布的《國家中長期動物疫病防治規劃(2012-2020年)》提出，2015年全國祖代以上種雞場的雞白痢沙門菌病達到凈化標準，2020年全國所有種雞場的雞白痢沙門菌病達到凈化標準。但目前我國部分育種場，曾祖代、祖代種雞場雞白痢抗體檢測結果很不理想，祖代種雞場仍然有部分雞出現雞白痢抗體陽性，建立新的快速準確的檢測方法有望加速此進程。雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌具有相同的菌體抗原，常用的血清學方法不能區分兩者。對兩者的區分主要依據生化特性的差異，他們對麥芽糖、衛矛醇、鳥氨酸等的發酵模式不同，但上述方法存在許多不足之處，耗時，重復性差。本試驗中建立的快速PCR鑒定方法，能快速準確鑒定同一血清型不同生物型沙門菌，在普通實驗室平臺上即可以實施。

1 材料與方法

1.1 菌株 本試驗所用雞傷寒沙門菌-生物型雞白痢沙門菌CMCC50771標準株、生物型雞傷寒沙門菌CMCC50770標準株,購自中國食品藥品檢定研究所;大腸桿菌菌株以及56株不同血清型沙門菌，其中雞傷寒沙門菌4株，雞白痢沙門菌33株，奧爾巴尼沙門菌6株，山夫頓堡沙門菌3株，倫敦沙門菌1株，嬰兒沙門菌2株，鴨沙門菌1株，田納西沙門菌3株，火雞沙門菌3株為江蘇省家禽科學研究所菌種庫保存。

1.2 主要試劑與儀器 2×TaqPlus PCR Master Mix試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;dNTP、DNA Marker DL-2 000,均購自寶生物工程(大連)有限公司;其他常規試劑均為國產分析級產品。PCR儀(Thermo Fisher 公司);MP120-2電子秤(上海肯強儀器有限公司);DYY-604型穩壓穩流電泳儀(南京新校園生物技術研究所)。

1.3 PCR引物的設計與合成 根據GenBank已公布的雞白痢和雞傷寒沙門菌全基因組序列，以及數據庫中其他不同血清型沙門菌全基因組序列，序列分析比對，篩選雞白痢和雞傷寒沙門菌血清型特異性基因片段，并根據所獲得的基因片段利用Primer Premier 6.0軟件設計引物，特異性引物信息如下：引物1-Up: 5′-TCG TTT ACG GCA TTA CAC AAG TA-3′；引物1-Lo:5′-CAA ACC CAG AGC CAA TCT TAT CT-3′；引物2-Up: 5′-TGT CGA CTG GGA CCC GCC CGC CCG C-3′；引物2-Lo:5′-CCA TCT TGT AGC GCA CCA T-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據序列分析結果，引物1和引物2的產物片段大小分別為417 bp和636 bp。

1.4 PCR模板的制備 采用煮沸裂解法[7]制備模板。從固體平板上挑取單菌落接種于液體培養基，37 ℃ 搖床培養過夜；次日取1 mL培養液，12 000 r/min 離心5 min，棄上清；用雙蒸水洗滌2次后用200 μL雙蒸水重懸，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清；于-20 ℃ 保存備用。

1.5 PCR擴增體系與程序 10×的PCR緩沖液2.5 μL，濃度各為25 mM的dGTP、dCTP、dATP、dTTP混合物0.5 μL，濃度為2.5 U/μLTaqDNA聚合酶1.25 μL，引物混合物1 μL，于一無菌的PCR反應薄壁管中。加入已制備好的待檢測模板1 μL，補水至總體積25 μL即可。PCR擴增程序：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 變性45 s、60 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸1 min,共25個循環，最后72 ℃ 延伸10 min后，PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 特異性檢測 56份已知血清型沙門菌LB過夜培養后，按1.4模板制備方法準備PCR模板，進行雙重PCR特異性檢測。

1.7 臨床樣本檢測 采集養殖場疑似雞白痢與雞傷寒沙門菌活禽棉拭子20份，將棉拭子接種于無菌的增菌培養基(亞硒酸鹽胱氨酸增菌液)37 ℃ 培養12 h。將渾濁培養液按1.4方法進行PCR模板制備，隨后進行雙重PCR檢測。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 雞白痢或者雞傷寒菌株經雙重PCR后均顯示417 bp條帶，其中雞白痢沙門菌菌株僅顯示417 bp條帶，而雞傷寒沙門菌菌株經雙重PCR結果后有2個條帶顯示，分別為417 bp，636 bp。上述試驗結果與預期序列分析結果相符，如圖1所示。

圖1 雞傷寒和雞白痢沙門菌雙重PCR檢測結果

M：Marker,DL-2 000；1：雞傷寒沙門菌；2：雞白痢沙門菌；3：陰性對照(大腸桿菌)

2.2 特異性檢測 本試驗中建立的雙重PCR檢測方法能檢測出56株不同血清型沙門菌中的4株雞傷寒沙門菌和33株雞白雞沙門菌，以其他血清型沙門菌為模板時，雙重PCR檢測結果顯示為陰性，這一結果說明本試驗中建立的雙重PCR方法能準確檢測出雞白痢與雞傷寒菌菌株，與其他血清型沙門菌具有較好的區分。

2.3 臨床樣本檢測 如圖2所示，20份樣品中，共有9份為陽性，其中含有雞白痢沙門菌8份(泳道1、3、7、8、11、14、17和18)，雞傷寒沙門菌1份(泳道5)。說明本試驗建立的方法可以很好的利用于臨床樣本的檢測。

圖2 臨床樣本雙重PCR檢測結果

1～20：不同臨床樣本；M：DL-2 000

3 討論

PCR技術是一種體外酶促擴增DNA技術，具有速度快、特異性強、靈敏度高等特點。運用PCR技術檢測沙門菌，其特異性主要取決于所擴增的靶序列是否是沙門菌高度保守的特異性片段以及引物的設計[8]。

為了增加對雞白痢沙門菌檢測的特異性，研究者建立了許多基于基因水平檢測的方法[9]，如PCR-RFLP，這種方法需要進行2個步驟才能達到檢測的目的，即PCR和RFLP[10]；目前已有針對雞傷寒沙門菌檢測的等位基因特異性PCR方法，但該方法不能特異性地鑒定雞傷寒沙門菌不同生物型—雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌，本試驗在分析不同血清型沙門菌全基因組序列的基礎上，篩選出雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌特異性基因序列，并以此為基礎設計2對引物，建立起雙重PCR方法鑒定雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌。

對已經過血清學鑒定的56株不同血清型沙門菌進行上述雙重PCR特異性檢驗，本試驗結果和細菌學結果完全一致，能將56株不同血清型沙門菌中3株雞傷寒沙門菌和33株雞白痢沙門菌菌株準確區分出來，這一結果表明，試驗建立的雙重PCR方法特異性較好。進一步將上述已經建立的雙重PCR方法應用于臨床樣本檢測，對臨床20份可疑樣本檢測結果顯示，8份雞白痢沙門菌陽性和1份雞傷寒沙門菌陽性檢出，這說明，這一方法可以應用于有簡單實驗室配置的生產企業。