秦皇島地區(qū)育成雞大腸桿菌血清型鑒定及耐藥性分析

李蘊(yùn)玉，葛 成，焦賀靜，王盛達(dá)，閆艷娟，李佩國(guó)，張召興，張香齋

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066604)

雞大腸桿菌病是危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)主要細(xì)菌性傳染性疾病之一，該病由不同血清型的致病性大腸桿菌引起不同日齡雞一系列疾病的總稱，臨床中主要表現(xiàn)敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎、滑膜炎、腹膜炎等多種病癥，可以通過多種途徑感染不同階段雞，發(fā)病率和死亡率均較高，給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。大腸桿菌廣泛存在環(huán)境中，其抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血清型眾多，可以感染家禽、家畜等多種動(dòng)物及人，是臨床中主要人畜共患的條件致病菌[3]。在養(yǎng)雞過程中，為了防治細(xì)菌性疾病，抗菌藥物大量的不合理使用，改變了大腸桿菌耐藥機(jī)制，出現(xiàn)許多耐藥菌株，使大腸桿菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，許多藥物由敏感變成耐藥，嚴(yán)重影響治療效果，同時(shí)也造成雞肉、雞蛋中嚴(yán)重藥物殘留，威脅人類的健康[4]。本試驗(yàn)從采集的秦皇島地區(qū)患病死亡育成雞38份肝臟病料組織中分離鑒定出20株大腸桿菌，并對(duì)分離的20株大腸桿菌進(jìn)行血清型檢測(cè)及耐藥性分析，以期為該地區(qū)育成雞的大腸桿菌病預(yù)防與治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 秦皇島地區(qū)患病死亡育成雞，無菌采集肝臟病料組織38份進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離與鑒定。

1.2 主要試劑與儀器 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、革蘭染色液試劑盒，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；生化鑒定試紙條購自法國(guó)梅里埃生物股份有限公司；DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均購自北京中科瑞泰生物科技有限公司；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O型血清因子購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；梯度PCR儀，德國(guó)eppendorf 公司生產(chǎn)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科技儀器有限公司；ATB自動(dòng)化微生物生化鑒定系統(tǒng)由法國(guó)梅里埃生物股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定 無菌采集病死雛雞肝臟組織劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12-18 h，挑取優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12-18 h。挑取單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中純化培養(yǎng)，革蘭染色鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 生化試驗(yàn)鑒定 將純化培養(yǎng)的分離菌調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋臃N于腸桿科生化鑒定試紙條中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24-48 h后，按照說明書操作，并用用ATB自動(dòng)化微生物生化鑒定系統(tǒng)對(duì)分離菌株生化特性鑒定。

1.5 細(xì)菌的16S rRNA PCR擴(kuò)增及測(cè)序 按參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rRNA序列，5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮方法提取細(xì)菌DNA組，進(jìn)行PCR鑒定。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 18 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，58.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取出5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)目的條帶，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行同源性分析。

1.6 細(xì)菌的血清型檢測(cè) 按參考文獻(xiàn)[6]，將20株分離菌株121 ℃滅菌2 h，破壞其K抗原，用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O型血清因子進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)，檢測(cè)分離菌株的血清型。

1.7 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷，分別用敏感(S)、中度敏感(I)、耐藥(R)表示。將20株分離菌株調(diào)整0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋鶆蛲磕ㄔ贛H培養(yǎng)基上，待菌液完全吸收后，貼上藥敏紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)12-18 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 將38份肝臟病料組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，其中20株分離菌株均在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形的、邊緣整齊的、大小一致的桃紅色菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形、帶有金屬光澤黑色或者褐色的菌落；革蘭染色鏡檢，分離菌株為兩端鈍圓、桿狀菌的革蘭陰性菌，與報(bào)道的大腸桿菌培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)觀察一致。

2.2 生化鑒定結(jié)果 20株分離菌株均發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖，能產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解尿素；V-P試驗(yàn)均為陰性，吲哚試驗(yàn)均為陽性。用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果均為大腸桿菌，評(píng)定結(jié)果合格率為99.8%～99.9%。

2.3 細(xì)菌的16S rRNA擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果 20株分離菌株用細(xì)菌的16S rRNA的通用引物，均擴(kuò)增出1 492 bp的目的條帶(圖1)；其測(cè)序結(jié)果與GenBank登錄的12株大腸桿菌參考菌株的同源性在98.9%～99%之間，從分子生物學(xué)角度證實(shí)了20株分離菌株為大腸桿菌。

圖1 部分分離菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

M:DL-2 000 Marker; 1～13:分離菌株；14:空白對(duì)照

2.4 細(xì)菌的血清型檢測(cè)結(jié)果 20株大腸桿菌分離菌株屬于5種血清型，以O(shè)1、O2、O78、O18、O89型分別占40.0%、30.0%、15.0%、10.0%、5.0%。

2.5 耐藥性分析結(jié)果 由表1可知，20株分離菌株對(duì)磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、林可霉素4種藥物耐藥性最高，耐藥率為100%；對(duì)頭孢拉啶、復(fù)方新諾明、青霉素、土霉素、氨芐西林、新霉素6種藥物耐藥率在75.0%～95.0%之間；對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢曲松、大觀霉素、氟苯尼考、卡那霉素6種藥物耐藥性在50.0%～65.0%；對(duì)其他藥物的耐藥率在5.0%～40.0%之間。

表1 20株大腸桿菌耐藥性分析結(jié)果

由圖2可知，20株大腸桿菌分離株4重以上耐藥菌株占100%，其中耐4、5、7、9、16、17、20種抗生素菌株各1株，占分離菌株的5.0%，耐12、14、15、18、19種抗生素菌株各2株，占分離菌株的10.0%，耐13種抗生素菌株3株，占分離菌株的15.0%。

圖2 20株大腸桿菌分離菌多重耐藥性分析結(jié)果

3 討論

根據(jù)大腸桿菌的遺傳特點(diǎn)和臨床癥狀可以分為腸道外致病性大腸桿菌、腸道內(nèi)致病性大腸桿菌、共生型大腸桿菌3個(gè)類型，其中腸道外致病性大腸桿菌和腸道內(nèi)致病性大腸桿菌是引起多種動(dòng)物及人類發(fā)病的主要大腸桿菌類型，尤其腸道外致病性大腸桿菌可以引起腸道以外器官感染，嚴(yán)重者可導(dǎo)致敗血癥等全身感染，雞的致病性大腸桿菌屬于腸道外致病性大腸桿菌[4]。大腸桿菌為環(huán)境中條件致病菌，其基因組復(fù)雜并攜帶多種毒力基因，該菌因攜帶毒力基因而產(chǎn)生很強(qiáng)的致病性，并且感染途徑廣泛，尤其當(dāng)外界條件改變時(shí)，導(dǎo)致動(dòng)物免疫力下降，可以引起該病發(fā)生與流行，另外一些病毒性疾病也可以繼發(fā)該病的發(fā)生。大腸桿菌血清型眾多復(fù)雜，不同地區(qū)流行血清型也不同，其致病性也存在一定的差異性。本試驗(yàn)從秦皇島采集的38份病死育成雞病料組織中分離到20株大腸桿菌，分離率52.6%(20/38)，分屬于5種血清型，以O(shè)1和O2為主要流行血清型。

大腸桿菌不同血清型菌株因缺乏交叉免疫保護(hù)性，給疫苗研制帶來了一定困難。故抗菌藥物成為防治雞大腸桿菌病主要方法。在養(yǎng)雞過程中由于抗菌藥物不合理的使用，致使大腸桿菌產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性。相關(guān)研究表明，雞大腸桿菌攜帶耐藥基因或者耐藥質(zhì)粒通過多種途徑轉(zhuǎn)移到人的體內(nèi)，可以產(chǎn)生相同的耐藥性，威脅著人類的健康[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，20株大腸桿菌分離菌株對(duì)磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、林可霉素4種藥物耐藥率為100%，對(duì)頭孢拉啶、復(fù)方新諾明、青霉素等12種藥藥物耐藥率在50.0%～95.0%之間，4重以上耐藥菌株占100%。該結(jié)果與毛福超等[8]、舒剛等[9]、楊盛智等[10]報(bào)道存在一定的差異性，可能與地區(qū)的血清型、抗生素使用的種類及劑量有關(guān)。因此，當(dāng)發(fā)生該病時(shí)，應(yīng)通過藥敏試驗(yàn)選擇高敏藥物，以提高治療效果，減少耐藥性的產(chǎn)生。同時(shí)要加強(qiáng)平時(shí)的飼養(yǎng)管理，注意養(yǎng)殖環(huán)境中的消毒。