葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對腸毒素大腸桿菌(ETEC)生長及毒力相關基因mRNA表達的影響

劉曉曦，張繼東，馬云飛，許劍琴

(1.廣東海洋大學農學院動物醫學系，廣東 湛江 524000；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193)

仔豬黃痢臨床特征具有瀉下急迫，糞色黃褐而臭，煩熱口渴等特點，基于中獸醫學理論可將其辨證為濕熱證，葛根芩連湯是治療濕熱證的經典方劑。中藥復方具有多成分、多途徑和多靶點的整體效應特點，葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿分別是葛根芩連湯中葛根、黃芩和黃連中的主要活性成分[1]。目前，已知葛根芩連湯中的葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿可以通過改善細胞形態、降低細胞炎癥反應等方式保護豬腸道上皮細胞，但葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對仔豬黃痢的致病菌腸毒素大腸桿菌 (ETEC) 的影響未見報道。因此作者將葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿與ETEC共培養后，通過檢測ETEC 的菌液濃度和外毒素基因mRNA的表達，探明葛根素等藥物對ETEC生長和分泌外毒素的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物的配置 葛根素(純度95.5%，編號110752-201313)，黃芩苷(純度93.3%，編號110714-201318)和鹽酸小檗堿(86.7%,編號110713-201212)購自中國食品藥品檢定研究院。用不含血清的無酚紅DMEM/F12培養基將葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿配置成初始濃度各為1 mg/mL的藥物溶液，備用。

1.2 細菌培養及分組 ETEC血清型為O149∶K91，K88ac，CVCC菌株編號為200，由中國農業大學動物科技學院張勤教授惠贈。用肉湯培養基增菌，用無酚紅的DMEM培養基調整ETEC菌液的初始濃度為2×106CFU/mL。細菌分對照組、葛根素組、黃芩苷組和鹽酸小檗堿組。對照組在37 ℃條件下，用無酚紅的DMEM培養基培養細菌9 h，用紫外可見分光光度計測定OD600值，記錄培養基中的細菌濃度。葛根素組是對照組的基礎上加入適量1 mg/mL 的葛根素，使其終濃度為200 μg/mL。同上，黃芩苷的終濃度為1 μg/mL，鹽酸小檗堿的終濃度為100 μg/mL。葛根素(200 μg/mL)、黃芩苷(1 μg/mL)和鹽酸小檗堿(100 μg/mL)與ETEC共培養9 h，觀察ETEC在1-9 h內的菌液濃度，以判斷葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿等藥物對ETEC生長情況的影響。

1.3 RNA提取及反轉錄 RNA提取：當ETEC培養到 3 h時，提取各組別內ETEC的RNA。按照Ambion RiboPure細菌試劑盒(Ambion,TX)的操作說明書提取ETEC的RNA。

用兩步法進行RNA逆轉錄，總反應體系為25 μL。首先配備反應體系13 μL(總RNA模板1.0 μg，Oligo (dT) 18為 1.0 μL，DEPC水11 μL)，PCR儀中70 ℃進行變性反應5 min，立即冰浴3 min。接著，在反應體系中加入以下試劑：1.25 μL的dNTPs (10 mmol/μL)，0.5 μL的RNasin (Ribonuclease Inhibitor,40 U/μL)，5.0 μL的M-MLV逆轉錄酶 5× Buffer，1.0 μL的M-MLV逆轉錄酶 (200 U/L)，以及4.25 μL的DEPC水。PCR儀中42 ℃反應1 h，將產物 cDNA立即使用或-20 ℃保存。

1.4 實時熒光定量PCR 將反轉錄產物進行實時熒光定量PCR，檢測ETEC外毒素基因STa、STb、LT以及菌毛蛋白亞基FaeG基因的表達。目的基因STa、STb、LT、FaeG及內參基因gapA[2]的引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物[4]

按照Agilent公司SYBR Green QPCR試劑盒使用說明書配制20 μL反應體系：10 μL Mix (2 ×)，0.3 μL ROX，1.0 μL cDNA模板，1.0 μL上游引物，1.0 μL下游引物，6.7 μL DEPC水。反應體系混勻后立即放入實時熒光定量PCR儀中，反應條件如下：第一步，95 ℃預變性10 min；第二步，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環40次；第三步，72 ℃再延伸8 min。溶解曲線反應條件如下：95 ℃ 1 min；58 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s。檢測結果用Mx 3000P (Stratagene,USA) 軟件得出。

1.5 數據分析 試驗結果用Mean ± SEM表示，應用統計軟件SPSS 20.0進行多重比較檢驗。試驗結果均采用Origin 6繪圖軟件制圖。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2 結果

2.1 葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對ETEC細菌生長曲線的影響 結果如圖1所示。相比于對照組培養的ETEC(107CFU/mL)，葛根素(200 μg/mL)和黃芩苷(1 μg/mL)只在0～3h內顯著降低了ETEC的濃度，表明葛根素和黃芩苷在細菌生長的前期或只對較低濃度的細菌有抑制作用。相比于對照組，鹽酸小檗堿(100 μg/mL)在9 h內均可顯著降低ETEC的濃度，表明鹽酸小檗堿可以抑制ETEC的生長。

圖1 葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對ETEC生長的影響

2.2 葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對ETEC亞基蛋白 FaeG mRNA表達的影響 結果如圖2所示。ETECFaeGmRNA的表達量可反映其菌毛亞基的表達情況。相比于對照組，葛根素(200 μg/mL)與ETEC共培養3 h后顯著降低FaeGmRNA的表達量至0.61倍，表明葛根素可以抑制ETEC菌毛亞基蛋白的表達；相比于對照組，黃芩苷(1 μg/mL)與ETEC共培養3 h后顯著升高FaeGmRNA的表達量至1.37倍，鹽酸小檗堿(100 μg/mL)與ETEC共培養3 h后顯著升高FaeGmRNA的表達量至12.48倍。以上結果表明，黃芩苷和鹽酸小檗堿可以促進ETEC菌毛亞基蛋白的表達。

圖2 葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對ETEC外毒素基因及FaeG mRNA的影響

2.3 葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對ETEC毒力因子mRNA表達的影響 結果如圖3所示。ETEC的STa,STb和LTmRNA的表達量可反映其外毒素的分泌情況。相比于對照組，葛根素(200 μg/mL)與ETEC共培養3 h后顯著降低STbmRNA的表達量至0.65倍，顯著升高ETEC內LTmRNA的表達量至1.4倍。相比于對照組，黃芩苷(1 μg/mL)與ETEC共培養3 h后顯著降低STamRNA的表達量至0.63倍，顯著降低STbmRNA的表達量至0.52倍，顯著降低LTmRNA的表達量至0.53倍。相比于對照組，鹽酸小檗堿(100 μg/mL)與ETEC共培養3 h后顯著升高STamRNA的表達量至6.03倍，升高STbmRNA的表達量至4.57倍，顯著升高LTmRNA的表達量至3.64倍。以上結果表明，葛根素和黃芩苷部分抑制了ETEC外毒素的分泌，但是鹽酸小檗堿顯著促進了ETEC外毒素的表達。

3 討論

前期試驗表明，葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿可以通過改善腸道上皮細胞形態、降低ETEC的粘附和炎癥反應以保護腸道結構[3]。目前有證據表明，中藥在治療疾病時其活性成分與腸道菌群的相互作用發揮了關鍵作用[4]。因此，研究中藥活性成分對產腸毒素大腸桿菌ETEC的調控作用具有重要意義。

圖3 葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對ETEC外毒素基因mRNA的影響

A： 葛根素對ETEC外毒素基因mRNA的影響；

B： 黃芩苷對ETEC外毒素基因mRNA的影響；

C： 鹽酸小檗堿對ETEC外毒素基因mRNA的影響

本試驗中藥物濃度是在葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對豬腸道上皮細胞的濃度基礎上決定的[5]，該濃度的藥物對細胞無毒性，能更好的模擬豬的腸道內部環境。相比于對照組，葛根素(200μg/mL)和黃芩苷(1μg/mL)在短時間內(3h)可以抑制ETEC的生長，而鹽酸小檗堿在0-9h內均可顯著抑制ETEC的生長，具有抑菌作用。FaeG是ETEC菌毛主要的亞基蛋白，它直接調節菌毛的粘附；ETEC通過粘附因子與特定受體結合后粘附在腸道上皮細胞表面，產生熱穩定毒素(ST)和熱不穩定毒素(LT)。相比于對照組，200μg/mL的葛根素顯著降低了ETEC內FaeG和STbmRNA的表達量，表明葛根素可抑制ETEC菌毛亞基蛋白和STb毒素的表達。相比于對照組，1μg/mL黃芩苷與100μg/mL鹽酸小檗堿顯著升高了ETEC內FaeGmRNA的表達量，表明黃芩苷和鹽酸小檗堿可促進ETEC菌毛亞基蛋白的表達。但是，這并不意味著黃芩苷和鹽酸小檗堿可以促進ETEC在豬腸道上皮的粘附，因為這兩個化合物可以通過下調腸道上皮細胞黏蛋白的方式阻斷ETEC的粘附[3]。相比于對照組，1μg/mL黃芩苷顯著降低了ETEC內STa、STb和LTmRNA的表達量，表明黃芩苷可顯著抑制ETEC分泌外毒素，降低ETEC的毒性，可在一定程度上降低ETEC對腸道的損傷。

100 μg/mL鹽酸小檗堿顯著升高了ETEC內STa、STb和LTmRNA的表達量，表明鹽酸小檗堿促進了ETEC分泌外毒素的能力。群落感應現象與細菌密度緊密相關，它是細菌個體與個體之間的交流機制，包括自動誘導因子2 的產生和分泌。菌毛蛋白FaeG與自動誘導因子2的活性密切相關，而自動誘導因子2 可以通過控制STa 和LT表達的變化調節ETEC毒力因子的表達。因此，菌毛蛋白FaeG的表達與STa和LT具有一定的相關性。在本試驗中，鹽酸小檗堿處理ETEC 3 h后，ETEC細菌濃度顯著降低，FaeG、STa和LTmRNA表達量顯著升高，這可能由于鹽酸小檗堿誘發了ETEC的群落感應，改變了自動誘導因子2的活性所導致的，但具體調控機制仍有待于進一步研究。綜上所述，葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿對ETEC的生長有一定的抑制作用，其中黃芩苷可顯著抑制ETEC分泌外毒素，降低ETEC的毒性。