苦參堿對PRRSV/LPS共刺激誘導小鼠炎癥反應的作用

孫盼盼，侯雅鑫，張宇瞳，趙 瑾，裴亞萍，孫 娜，徐銀蘭，何永明，李宏全

(1.山西農業大學動物科技學院，山西 太谷 030801；2. 佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528225)

近幾年，中藥及其提取物在防治動物疾病、提高機體免疫功能、緩解炎癥反應等臨床應用中顯示出良好的效果?？鄥A(Matrine，MT)是從苦參、山豆根和苦豆子等藥用植物的根莖中提取分離的一類生物堿，已有文獻報道，苦參堿能減輕卵清蛋白誘導的小鼠呼吸道炎癥[1]；以IL-10缺陷引起的小鼠腸炎為模型，苦參堿可抑制TNF-α等促炎因子的釋放，緩解腸炎癥狀[2]；本實驗室前期研究表明，苦參堿對豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)/豬圓環病毒2型(PCV2)共感染誘導的小鼠間質性肺炎有顯著的治療作用，并且改善脂多糖(LPS)誘導的小鼠急性肺損傷[3-4]。這些結果提示苦參堿具有抗炎作用，但是其具體的抗炎機理還不清楚。

豬感染PRRSV后的主要臨床癥狀是繁殖障礙和間質性肺炎，并且以出現免疫抑制為特點，常與其他豬病混合感染或者繼發感染，而與其他病原體的共感染在PRRSV誘導的炎癥反應中也具有重要地位[4-8]。本實驗室前期試驗結果顯示，苦參堿能夠抑制PRRSV在Marc-145細胞和豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophages，PAMs)中的復制[9-11]；PRRSV 5'UTR RNA和LPS共刺激PAMs后，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達顯著高于各單獨作用組，而苦參堿作用后能顯著降低這些促炎因子的表達[12]。因此，本試驗通過PRRSV和LPS共刺激小鼠為模型，檢測苦參堿對PRRSV/LPS共刺激誘導小鼠炎癥反應的影響，探索苦參堿可能的抗炎機制，為苦參堿作為抗PRRSV藥物的臨床應用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物、病毒和實驗動物 苦參堿購自中國南京澤郎生物科技有限公司，批號：ZL20171212SCZS，含量98.0%。PRRSV(JS-1)由江蘇省農業科學院贈，經Marc-145細胞增殖后測定病毒TCID50為10-5.86。雌性昆明系小鼠，清潔級，體重20±2 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 LPS、蘇木素染色液、伊紅染色液和中性樹膠,購自北京索萊寶科技有限公司；TRIZol和PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,購自大連TakaRa公司；2×SYBR Green Low ROX qPCR Master Mix,購自上海畢傲圖生物科技有限公司；小鼠Th17/Treg細胞表型檢測試劑盒,購自美國BD公司。ND-1 000核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop，美國)；ABI 7 500定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)；離心機(Sigma，德國)；全自動血液細胞分析儀(Healife，中國)；全自動生物組織切片機(Leica，德國)；光學顯微鏡(Olympus，日本)；FACS Calibur流式細胞儀(BD，美國)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 將100只雌性昆明系小鼠隨機分為5組(空白組、LPS組、PRRSV組、PRRSV和LPS組、苦參堿作用組)，每組20只。LPS作用組：腹腔注射20 mg/kg·bw LPS；PRRSV作用組：PRRSV 10倍稀釋后腹腔注射0.5 mL；LPS和PRRSV共刺激組：同時給予LPS和PRRSV；苦參堿作用組：LPS和PRRSV共刺激30 min后，每只小鼠以40 mg/kg·bw的劑量,腹腔注射苦參堿，每隔24 h給藥1次，連續給藥3次；空白對照組:注射等體積生理鹽水。PRRSV和LPS共刺激1 d和7 d后，每組隨機選取10只小鼠剖檢，采集血液，固定及凍存肺臟，分離提取脾臟細胞。

1.2.2 血液中白細胞數的檢測 收集血液，采用全自動血液細胞分析儀進行血常規檢測，統計各組小鼠白細胞、淋巴細胞、單核細胞和粒細胞數的變化。

1.2.3 肺組織病理學觀察 取部分左肺，用苦味酸溶液固定24 h后，經脫水、透明、石蠟包埋，切片，然后進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，H.E.)染色，光鏡下觀察小鼠肺組織的病理形態學變化。

1.2.4 qRT-PCR檢測小鼠肺組織中IL-1β、TNF-α mRNA表達量 取凍存的肺組織放到預冷的研缽中，充分碾磨后，加入1 mL TRIZol，按說明書提取組織總RNA。以合成的cDNA為模板，β-actin為內參基因，采用相對熒光定量PCR(2-ΔΔCt)檢測各個樣本中IL-1β、TNF-α mRNA的相對表達量。

表1 引物序列及PCR產物大小

1.2.5 脾細胞中Th17、Treg細胞數的檢測 分離小鼠脾臟后，無菌生理鹽水洗凈脾臟表面血漬，剪碎研磨后過濾，1 500 r/min離心5 min，棄上清，紅細胞裂解液裂解紅細胞后，PBS洗2遍，經細胞計數后用2% 1 640培養基重懸細胞。按照美國BD公司小鼠Th17/Treg細胞表型檢測試劑盒說明書進行抗體孵育，流式細胞術檢測脾淋巴細胞中Th17/Treg細胞的變化。

1.3 數據分析 所有數據均采用GraphPad Prism 5軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，流式細胞儀數據用 CELL Quest 軟件獲取，結果均以Mean ± SEM表示。

2 結果

2.1 苦參堿抑制PRRSV/LPS共刺激引起的小鼠肺臟病變 H.E.染色結果顯示，1 d和7 d時，空白組小鼠肺組織結構清晰，肺泡結構完整，肺泡壁厚度正常(見中插彩版圖1)。LPS、PRRSV單獨刺激誘導小鼠肺臟發生病理變化，但共刺激組小鼠肺組織病變程度更嚴重，表現為結構不清晰，肺間隔明顯增寬、肺泡腔顯著縮小等典型的間質性肺炎特征；苦參堿處理后能顯著改善肺間隔增寬等病理現象。

2.2 苦參堿對PRRSV/LPS共刺激小鼠白細胞含量的影響 白細胞是一類無色、球形、有核的血細胞，根據其形態、功能和來源部位可分為3大類：粒細胞、單核細胞和淋巴細胞。機體發生炎癥反應時可引起白細胞總數及各種白細胞的百分比發生變化，血常規檢測結果顯示(圖2)，PRRSV和LPS共刺激小鼠1 d時，與空白組相比，LPS單獨刺激和共刺激組中白細胞和淋巴細胞數顯著降低(P<0.05)；單獨PRRSV刺激顯著升高白細胞和淋巴細胞數(P<0.05)；所有刺激對單核細胞和粒細胞數沒有顯著影響(P>0.05)。與共刺激組相比，苦參堿處理對各種血細胞的含量沒有顯著影響(P>0.05)。在7 d時，與空白組相比，LPS單獨刺激和共刺激組中淋巴細胞數顯著升高(P<0.05)，粒細胞、單核細胞以及淋巴細胞數沒有顯著變化(P>0.05)；PRRSV單獨刺激對各種白細胞的含量沒有顯著影響(P>0.05)。與共刺激組相比，苦參堿處理顯著降低單核細胞數，對其他3種血細胞的含量沒有顯著影響(P>0.05)。

圖2 苦參堿對PRRSV/LPS共刺激小鼠血液中白細胞、粒細胞、單核細胞以及淋巴細胞含量的影響

注：不同字母a、b、c表示差異顯著，P<0.05

2.3 苦參堿對PRRSV/LPS共刺激小鼠肺臟TNF-α和IL-1β mRNA的影響 熒光定量PCR檢測結果顯示，在PRRSV和LPS共刺激1 d時，與空白組相比，PRRSV或LPS單獨刺激對IL-1β(圖3A)和TNF-α(圖3B)的表達沒有顯著影響(P>0.05)，共刺激顯著升高肺臟中TNF-α的表達(圖3B)(P<0.05)，對IL-1β的表達沒有影響(圖3A)(P>0.05)；與共刺激組相比，苦參堿處理后顯著降低肺臟中TNF-α的表達(圖3B)(P<0.05)，對IL-1β的表達沒有影響(圖3A)(P>0.05)。在7 d時，PRRSV單獨刺激顯著升高IL-1β的表達(圖3C)，LPS單獨刺激對IL-1β和TNF-α的表達沒有顯著影響(圖3C和圖3D)(P>0.05)，PRRSV和LPS共刺激顯著升高肺臟中IL-1β和TNF-α的表達(圖3C和圖3D)(P<0.05)；與共刺激組相比，苦參堿處理顯著抑制IL-1β的表達(圖3C)(P<0.05)，對TNF-α的表達沒有影響(圖3D)(P>0.05)。

圖3 苦參堿對PRRSV/LPS共刺激小鼠肺臟IL-1β和TNF-α mRNA的影響

注：不同字母a、b、c、d表示差異顯著，P<0.05

2.4 苦參堿對PRRSV/LPS共刺激小鼠脾臟Th17和Treg細胞的影響 在PRRSV和LPS共刺激1 d時，與空白組相比，PRRSV和LPS共刺激組中Treg細胞的表達顯著升高(P<0.05)，Th17細胞的表達沒有顯著變化(P>0.05)；與共刺激組相比，苦參堿處理對Treg和Th17細胞的的表達均沒有顯著影響(P>0.05)。在7 d時，與空白組相比，PRRSV和LPS共刺激對Th17和Treg細胞的表達沒有顯著影響(P>0.05)，苦參堿處理后對Th17和Treg細胞的表達沒有顯著影響(P>0.05)(圖4)。

3 討論

多種病原混合感染是臨床上常見的感染模式，臨床上PRRSV常與豬圓環病毒、胸膜肺炎放線桿菌和鏈球菌等病原微生物混合感染，這些混合感染給豬病的防治帶來很大的難題[6-8]。已有的研究報道，PRRSV雖然不能在小鼠體內復制，但是卻能引起小鼠脾臟的氧化應激反應，IL-10和TNF-α的表達顯著升高[13]。本試驗通過PRRSV和LPS共刺激昆明系小鼠，結果顯示，共刺激誘導更嚴重的肺臟病理變化，呈典型的間質性肺炎，苦參堿處理后能夠改善小鼠的間質性肺炎癥狀。這些結果提示苦參堿具有抗炎作用，但是其具體的抗炎機制還未闡明。

白細胞、血小板計數與多種疾病活動有關，機體發生炎癥或其他疾病時可引起白細胞總數及各種白細胞的百分比發生變化，因此檢查白細胞總數及白細胞分類計數成為輔助診斷的一種重要方法[14-15]。血常規檢查是目前臨床最常用的實驗室檢測項目之一，本試驗通過PRRSV和LPS共刺激昆明系小鼠，血常規檢測結果顯示，共刺激影響血液中白細胞、淋巴細胞、單核細胞和粒細胞數，苦參堿處理后能夠緩解這種變化。這些結果同時還提示在共刺激早期，LPS在誘導白細胞變化中發揮主要作用，隨著刺激時間的延長，PRRSV能夠協同LPS誘導的白細胞變化，而苦參堿可調節白細胞含量的變化。

圖4 苦參堿對脾淋巴細胞中Th17、Treg細胞的影響

*表示與空白組相比差異顯著，P<0.05

炎癥是臨床最常見的病理過程，炎癥因子表達量的變化在炎癥反應中發揮重要作用。IL-1β和TNF-α是重要的致炎性細胞因子[16]。已有的研究表明,LPS和PRRSV協同作用顯著增加細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌[17]。PRRSV感染可升高RAW264.7細胞以及小鼠脾臟勻漿內TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的水平[13,18]。本試驗結果表明，PRRSV和LPS共刺激協同影響TNF-α的表達，LPS影響早期(1 d)IL-1β的表達，PRRSV影響晚期(7 d)IL-1β的表達，而苦參堿在不同刺激時間通過影響TNF-α和IL-1β的表達來抑制PRRSV和LPS共刺激誘導的炎癥反應。

Th17細胞(T help cell 17，Th17)和Treg細胞(Regulatory T lymphocyte，Treg)是近年來新發現的CD4+T細胞亞群[20]。近年來研究發現，正常機體內存在著Th17/Treg動態平衡，Th17/Treg失衡可促進自身免疫性疾病炎癥反應的發生。研究表明，中藥解毒化瘀湯和脾酪氨酸激酶抑制劑均能夠通過調節Th17/Treg細胞平衡調節機體炎癥反應[19-20]。而本試驗的研究結果顯示，PRRSV與LPS共刺激僅在1 d時影響Treg細胞的表達；苦參堿處理后對Treg和Th17細胞的表達沒有影響，表明苦參堿不通過影響Treg/Th17細胞平衡來抑制PRRSV和LPS共刺激誘導的小鼠炎癥反應。與此同時，qRT-PCR檢測結果顯示,共刺激和苦參堿處理對小鼠脾臟炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達均沒有顯著影響(數據未顯示)。

綜上所述，PRRSV和LPS共刺激誘導小鼠嚴重的炎癥反應，主要表現為典型的間質性肺炎，肺間隔明顯增寬、肺泡腔顯著縮小等，苦參堿處理后通過影響血液中各種白細胞的表達以及肺臟中IL-1β和TNF-α的表達來抑制炎癥反應，改善共刺激誘導的間質性肺炎。