1例土雞多種病原混合感染引起關節炎的診斷

梁競臻，徐子恒，王威威，張遠琴，石夢雅，汪 敏，韋 平

(廣西大學養禽與禽病學研究所，廣西 南寧 530005)

雞關節炎是養禽業中較常見的一種疾病，可由細菌、病毒和支原體引起。其中細菌性關節炎主要是由大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌等引起；病毒性關節炎主要由禽呼腸孤病毒(ARV)引起；支原體病是由雞滑液囊支原體(MS)引起。此外，某些營養性疾病如日糧中缺乏維生素D、日糧蛋白水平過高引起痛風和缺乏某些必需無機元素時也可引起雞關節炎的發生[1]。雞關節炎的主要癥狀為關節腫脹、發炎、單側或雙側跛行，嚴重時病雞臥地不起，造成行動不便、采食困難等[2]。

近年來，隨著我國集約化養雞業的快速發展，雞關節炎不再是單一病原引起的疾病，多種病原混合感染引起雞關節炎的現象普遍發生[3]。目前多發性雞關節炎的流行在我國養雞業中呈上升趨勢，不僅影響雞群生長發育，造成死淘率增加，給養雞業帶來巨大的經濟損失，同時，由于其病原呈多樣性，且癥狀大多相似，也給疾病的診斷帶來困難[4]。2018年10月，廣西大學養禽與禽病研究所接診了一起土雞混合感染引起關節炎的病例，根據雞群發病情況、臨床癥狀、剖檢病變和實驗室病原檢測，確診該雞群為滑液囊支原體、細菌、禽呼腸孤病毒的單一或多種病原混合感染所致。結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基 試劑：革蘭染液、瑞氏染色液及常規生化試劑盒，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；沙門菌屬診斷血清(60種)、沙門菌屬A～F多價診斷血清，購自寧波天潤生物藥業有限公司；16種常規藥物的藥敏紙片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒，均購自大連寶生物工程有限公司；PCR試劑，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker為TaKaRa公司產品。

培養基:緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱鹽酸增菌液(SC)、麥康凱培養基、木糖賴氨酸脫氧膽酸瓊脂(XLD)培養基及普通營養瓊脂，均購自北京陸橋生物技術有限責任公司；鮮血瓊脂培養基和生理鹽水由廣西大學養禽與禽病學研究所自行配制。

1.2 流行病學 廣西南寧市某養殖公司送檢2批(A組和B組)不同日齡的土雞：A組為4只50日齡土雞，B組為7只55日齡。發病雞群大約各10 000羽，于46日齡起開始發病，病雞表現為羽毛蓬亂、精神萎靡，身體前傾、無法站立，久臥不起、不愿走動；個別雞只關節腫大、跛行，靜臥時倒向一側；部分病雞伴有不同程度的拉稀。送檢時累計發病率為30%，死亡率為0。

1.3 方法

1.3.1 剖檢 撲殺全部送檢病雞并剖檢，按雞的日齡分組(A：50日齡、B：55日齡)，統計病理變化。

1.3.2 禽呼腸孤病毒(ARV)和雞滑液囊支原體(MS)的檢測 ARV的RT-PCR檢測：無菌取送檢病雞的關節滲出物、病變組織，剪碎后用無菌研缽充分研磨，并用滅菌生理鹽水制成1∶5懸液，反復凍融3次后提取RNA，根據Xie等[5]建立的方法進行ARV的RT-PCR檢測。

MS的培養檢測：無菌取病雞腫脹關節滲出物于增菌培養液中，置37 ℃搖床培養24 h，然后用DNA抽提試劑盒的方法提取DNA 樣品，參照謝芝勛等[6]建立的 MS 檢測法進行PCR檢測。

1.3.3 細菌的分離培養鑒定 無菌取病雞病變組織、骨髓及關節液直接劃線，分別接種于鮮血瓊脂培養基中，37 ℃培養18-24 h，觀察菌落形態，挑取可疑菌落進行革蘭染色、瑞氏染色以及常規生化試驗鑒定[7-9]。

此外，參照GB4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門菌檢驗》中的培養方法，無菌采集病雞有典型病變的肝臟、骨髓或關節炎癥物1 g，剪碎后置于10 mL緩沖蛋白胨水(BPW)中預增菌，37 ℃培養18-24 h，各蘸取一環增菌液劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養18-24 h，觀察菌落形態；同時，分別取上述 BPW預增菌液1 mL于9 mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液中，37 ℃培養18-24 h，分別劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂平板上，繼續37 ℃培養18-24 h。挑取XLD平板上可疑沙門菌的單菌落，劃線接種到普通營養瓊脂平板上純培養，在37 ℃下培養18-24 h，用沙門菌屬A～F多價血清做平板凝集試驗和PCR檢測，進一步確定是否為沙門菌。PCR檢測參照趙志偉論文[10]中提到的沙門菌invA基因PCR試驗方法以及耿士忠等[11]論文里提到的雞白痢rfbS基因特異性PCR試驗方法。

1.3.4 分離株藥敏試驗 將分離到的細菌分別接種到普通營養瓊脂平板上進行純培養，并參考美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)的標準[12]，采取K-B紙片擴散法[13]對分離株進行16種常見藥物的敏感性試驗。判定標準：抑菌圈直徑≤6 mm為不敏感;>6～≤10 mm為低敏;>10～≤20 mm為中敏;>20 mm為高敏。

2 結果

2.1 病雞病變統計 A組：關節有白色滲出液(2/4)或黃色干酪樣物(1/4)、股骨頭壞死(1/4)、肝臟發綠(1/4)、肝臟有灰白色壞死點(2/4)。B組：關節有淡黃色混濁黏液(5/7)或淡黃色透明液體(1/7)、關節有黃色干酪樣物(1/7)、肌腱出血(1/7)、心包積液(1/7)、肝臟腫大且有灰白色壞死點(2/7)、股骨頭壞死(1/7)(見中插彩版圖1)。

2.2 ARV和MS的檢測

2.2.1 ARV的RT-PCR檢測 A組ARV呈陽性(0/2)、B組ARV呈陽性(1/2)，陽性樣品在534 bp處擴增出特異性條帶，電泳結果見圖2。

2.2.2 MS的PCR檢測結果 A組MS呈陽性(2/2)、B組MS呈陽性(3/3)，陽性樣品在399 bp處擴增出特異性條帶，電泳結果見圖3。

2.3 細菌分離及鑒定

2.3.1 血平板培養檢測 用血平板從關節和肝臟中分離到3種明顯不同的細菌。通過觀察菌落形態，挑取可疑菌落進行革蘭染色、瑞氏染色以及常規生化試驗鑒定，根據其結果，初步鑒定為大腸桿菌(1/11)、葡萄球菌(3/11)和溶血性巴氏桿菌(1/11)。

2.3.2 國標培養檢測 參照國標方法來進行培養的檢測結果顯示：大腸桿菌(2/11)、沙門菌(1/11)。其中，經血清學、生化試驗及PCR檢測確定沙門菌血清型為雞白痢沙門菌。圖4為沙門菌屬invA基因PCR結果和雞白痢沙門菌rfbS基因PCR結果。從圖4發現分離株中均在invA基因的目的條帶395 bp左右處有陽性擴增，為沙門菌；在rfbS基因的目的條帶400 bp處有陽性擴增，為雞白痢沙門菌。

圖2 ARV PT- PCR檢測結果

M：DL-2 000 DNA Marker；1：ARV陰性對照；2：ARV陽性對照；3：陽性樣品ARV引物基因的擴增

圖3 MS PCR檢測結果

M：DL-2 000 DNA Marker；1：MS陰性對照；2：MS陽性對照； 3～4：A組樣品MS引物基因的擴增； 5～7：B組樣品MS引物基因的擴增

圖4 沙門菌PCR檢測結果

M：DL-2 000 DNA Marker；1：invA基因陰性對照；2：invA基因陽性對照；3：樣品invA基因的擴增；4：rfbS基因陰性對照； 5：rfbS基因陽性對照；6：樣品rfbS基因的擴增

2.4 兩群雞各病原檢測情況 A組各病原檢測結果：細菌培養檢測中，葡萄球菌(1/4)、大腸桿菌(2/4)、沙門菌(0/4)、溶血性巴氏桿菌(1/4)，ARV PT-PCR檢測陽性(0/4)，MS培養檢測陽性(2/2)。見表1。

表1 A組各病原檢測情況

+:為陽性檢測結果,下表同

B組各病原檢測結果為：細菌培養檢測中，葡萄球菌(2/7)、大腸桿菌(2/7)、沙門菌(1/7)、溶血性巴氏桿菌(0/7)，ARV RT-PCR檢測陽性(1/7)，MS培養檢測陽性(3/3),見表2。

表2 B組各病原檢測情況

2.5 分離株藥敏試驗 藥敏試驗結果顯示：4種分離菌株對復方新諾明、萘啶酸、磺胺異噁唑、甲氧嘧啶均不敏感；對頭孢曲松、呋喃妥因高敏；對頭孢噻肟、頭孢他啶、阿米卡星、鏈霉素、卡那霉素、四環素、環丙沙星和慶大霉素均產生不同程度的敏感性。

3 討論

近年來，隨著我國養雞業規模化和集約化水平的提高，單一營養因素引起的雞關節炎逐漸減少[14]，然而，在雞的生產性能不斷得到提高的同時，由不利環境因素和多種病原引起混合感染的雞關節炎病不斷增加，成為一個嚴重制約養雞業發展的問題。這種病比單一感染更多見，而且診斷難度加大。由于雞關節炎病原呈多樣性，引起的臨床癥狀相似，肉眼一般很難鑒別診斷，需要應用實驗室診斷技術確診[15]。

本病例中，根據流行病學、剖檢病變、實驗室病原檢測結果以及這些雞群均未接種ARV弱毒疫苗和發病后也未使用任何藥物等情況，最終確診送檢雞群為MS、細菌、ARV的單一或多種病原混合感染所致。按照感染類型劃分，A組：單一細菌感染引起關節炎2只(50%)；單一MS感染1只(25%)；細菌和MS混合感染1只(25%)。B組：單一細菌感染引起關節炎3只(42.9%)；單一MS感染2只(28.6%)；細菌和MS混合感染1只(14.3%)；細菌和ARV混合感染1只(14.3%)。結果顯示，單一細菌感染的比例較高，其中分離到大腸桿菌(2/5)、葡萄球菌(2/5)、雞白痢沙門菌(1/5)。對比本實驗室近10多年接診的病例檢測記錄發現，由大腸桿菌、沙門菌、葡萄球菌等環境中常見的條件性致病菌引起的細菌性關節炎較為常見[4,15-16]。細菌可廣泛存在于帶菌雞排出的糞便、污水以及潮濕的生活環境中，一旦感染，可在雞體內滋生繁殖，如果其伴隨體液進入關節腔便會引起雞體關節腫大[17]。為避免水平傳播，雞群飼養多為籠養，但Wideman等[18]研究表明，在鐵絲網上籠養的雞，由于網面的不穩定性，會促進細菌的增殖，因此很大程度上加重細菌性股骨頭壞死的發生。本病例中，從股骨頭壞死的病雞中只分離到了細菌，沒有檢測到其他可引起關節炎發病的病原，與其他該類型病例檢測結果相符[17,19]。從藥敏試驗結果可以看出，分離株對復方新諾明、萘啶酸等抗生素均不敏感。盡管該雞場發病后未使用任何藥物，但多數養殖場將抗生素作為飼料添加劑使用，已使病原菌產生了較強的耐藥性。

本次發病雞群中，MS、ARV也是引起發病的原因之一。MS傳播方式廣泛，雞群一旦感染，不易徹底清除，且易混合感染其他疾病，使病情復雜化[3]。此次病原檢測結果顯示，兩組雞中均出現細菌和MS混合感染的現象，各分離到的1株細菌，分別為溶血性巴氏桿菌和大腸桿菌。MS目前尚無有效的特異性治療方法，主要通過有效的生物安全措施和雞群凈化進行防控[1]，也可通過弱毒疫苗和滅活油苗控制感染，減少損失[15]。據了解，該雞群未免疫過MS疫苗，這可能是導致雞群感染MS的原因之一。本次病例中，ARV只在B群1只雞中檢測到，同時分離到了葡萄球菌，說明ARV不是該病發生的主要原因，但也應引起重視。歐陽文軍等[20]研究表明，禽類在感染ARV后，可以加重其他病原體引起的疾病。

綜上所述，引起雞關節炎的因素較多，病原呈多樣性，也給疾病的診斷帶來一定難度。雞關節炎發生后，首先應用實驗室診斷技術進行確診，然后再根據不同的病因制定防控措施。針對該雞場發病的情況，可采取以下措施進行后續防治工作：(1)加強養殖場日常飼養管理，嚴格制定并實施合理的生物安全措施；(2)加強種雞群凈化工作，對發病雞應及時淘汰，以防疾病通過垂直傳播給后代，造成肉雞的垂直感染；(3)應結合藥敏試驗選用敏感度高的藥物進行治療，可用不同藥物輪換使用，避免因使用單一藥物而產生耐藥菌，平時也應減少抗生素在飼料、飲水中的使用；(4)可將MS、ARV疫苗接種納入免疫程序中，加強雞群免疫及其效果，避免MS、ARV感染帶來的經濟損失。