不同濃度表皮生長因子(EGF)對雞胚盲腸上皮細胞生長的影響

段步婷，席 柔，李瑞琪，張雪松，張 黎，古少鵬，鄭明學，白 瑞

(山西農業大學動物科技學院，山西 太谷 030801)

雞球蟲病不利于全世界養禽業的持續健康發展[1]，而9種球蟲中危害最大的是柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)[2]，其主要侵害盲腸。由于現階段關于雞球蟲病的入侵和損傷機制的研究并不充分，也就無法研制抑制或阻斷E.tenella損傷宿主細胞的藥物[3]。目前大部分關于E.tenella的研究通常將原代雞肺上皮細胞以及雞胚腎細胞作為宿主細胞[4]，但是事實上盲腸上皮細胞才是E.tenella的宿主細胞。因此為了更好地研究E.tenella損傷機制以及抗球蟲藥，所以需要研究盲腸上皮細胞體外培養技術。

表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)是調節細胞周期的一種外源性因子，它對細胞周期的調節作用主要表現在可以縮短細胞分裂的時間[5]。EGF的肽鏈由50～60個氨基酸構成，每條鏈中含有6個半胱氨酸分子，各個半胱氨酸分子間形成穩定的雙硫鍵，使整條肽鏈成為3個環聯部分的活性物質。EGF發揮作用主要是通過與表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)的結合，激發受體內在的絡氨酸激酶的活性，從而啟動信號傳導級聯，導致多種生物化學變化，細胞內鈣水平上升，增加糖酵解與蛋白質合成，增加某些基因(包括EGFR)的表達，最終導致DNA合成和細胞增殖，因此EGF對細胞的生長和增殖有明顯的調節作用[6-7]。有研究證實，EGF對牛前脂肪細胞、牛輸卵管上皮細胞、羊毛囊干細胞、小鼠精原干細胞、人表皮細胞、視網膜色素上皮細胞等有促進生長、增殖的影響[8-12]。但是關于雞盲腸上皮細胞的影響的報道并不多見。本試驗對雞胚盲腸上皮細胞進行不同濃度EGF的刺激培養，探究EGF是否能促進雞胚盲腸上皮細胞增殖生長，選出最適合盲腸上皮細胞生長的培養體系，為體外建立雞胚盲腸上皮細胞系和適合E.tenella繁殖的細胞模型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 15日齡雞胚,購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司的SPF種蛋孵化而來。

1.1.2 主要試劑 PBS(Solarbio公司);胎牛血清(四季青公司);表皮生長因子(EGF，Sigma公司);0.4%臺盼藍(Solarbio公司);DMEM/F12培養基(Sigma公司);0.25%胰酶-EDTA(Gibco公司);二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司);MTT試劑盒(Solarbio公司);嗜熱菌蛋白酶(Sigma公司);堿性磷酸酶(Sigma公司);肝素鈉(Sigma公司);胰島素(Sigma公司);丙酮酸鈉(Solarbio公司);L-谷氨酰胺(Solarbio公司);青鏈霉素混合液(Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 正常雞胚盲腸上皮細胞的培養 取15日齡的SPF雞胚，在無菌環境下取出盲腸，縱向切開盲腸，然后置于含雙抗預冷的D-PBS中漂洗35次，去除污血。用眼科鑷去除周圍的腸系膜用眼科剪將盲腸組織剪碎，剪碎后的組織加入50 μg/mL嗜熱菌蛋白酶，然后將其置于振蕩培養箱中120 min(37 ℃，80 r/min)，從而起到震蕩消化的作用。取出消化組織，加入PBS液終止消化并用吸管輕輕吹打5 min，待細胞塊完全散開后，經120目不銹鋼篩過濾，將過濾液轉入離心管，繼續加PBS至懸浮液清亮，然后將其放置于離心機中5 min(1 000 r/min)，去掉PBS和酶液。離心所得沉淀用含10%胎牛血清(FBS)的細胞培養基(1.5 mL/雞胚)重懸并混勻，2.5 mL/瓶接種于細胞培養瓶內，貼壁培養70 min(41 ℃、8%CO2)，用來去除成纖維細胞。取出細胞貼壁瓶并輕輕搖晃，將沉至瓶底的細胞團塊重新懸浮，收集貼壁瓶中的懸液，將懸液放置于離心機中5 min(1 000 r/min)，沉淀用含2.5%FBS的原代細胞培養基懸浮并收集培養瓶中的懸液，離心計數，將細胞團塊以20萬(2 mL)/孔接種于細胞培養板內，放置于CO2培養箱內(41 ℃、8%CO2)，定期換液(48 h/次)，期間每天觀察細胞的生長情況。

1.2.2 EGF對雞胚盲腸上皮細胞增殖率的測定 在處于對數成長期的細胞中加入適量的0.25%胰酶-EDTA從而起到消化的作用，然后將細胞接種于96孔板內(2×104個細胞/孔)，放置于CO2培養箱中12 h(41 ℃、8%)，然后去除上清液后設置每組EGF的濃度分別為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL，每一濃度3個孔。放置于CO2培養箱中孵育4 d(41 ℃，8%)，孵育期間每間隔2 d進行1次換液。EGF作用4 d后，加MTT溶液20 μL/孔。于41 ℃、8%CO2培養箱中繼續孵育4 h，用膠頭滴管吸棄上清液。然后每孔加150 μL DMSO，轉移到酶標儀上在490 nm波長下測定各孔吸光度值，每組取3個平行樣本的平均值。

1.2.3 雞胚盲腸上皮細胞生長曲線(率)的測定 通過確定出最佳濃度EGF，然后配制出適合雞胚盲腸上皮細胞生長的培養基，然后將細胞接種于96孔板內(2×104個細胞/孔)，進行培養。于細胞接種后1-8 d每天用MTT法檢測細胞活力(每組每天3孔)，未計數細胞每2 d換液1次。自動酶標儀490 nm測定OD值，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 堿性磷酸酶染色 采用古少鵬等[13]方法，將制備的雞胚盲腸上皮細胞懸液接種于胎牛血清包被過的爬片上，置于48孔培養板中放在培養箱中培養(41 ℃，8%)，待細胞長至80%時，用預冷的PBS漂洗3次，10%多聚甲醛固定2 h，偶氮偶聯法染色，光鏡下觀察。

1.3 統計學處理 使用SPSS Statistics V22.0統計學軟件對試驗結果數據進行單因素ANOVA檢驗，各組試驗結果以平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 雞胚盲腸上皮細胞形態學觀察 添加不同濃度的EGF與雞胚盲腸上皮細胞中，在培養基中不添加EGF的培養72 h后，放在倒置顯微鏡下觀察細胞呈圓形(見中插彩版圖1A)；向培養基里添加10 ng/mL的EGF作用72 h后，細胞的數量增多，而且向外伸展(見中插彩版圖1B)；添加20 ng/mL的EGF的細胞數量明顯增多，而且呈現鋪路石樣(見中插彩版圖1C)；添加30 ng/mL EGF，細胞數量也明顯增多，與20 ng/mL組細胞數差異不明顯(見中插彩版圖1D)；40 ng/mL細胞數量較30 ng/mL細胞數差異不明顯(見中插彩版圖1E)，添加20 ng/mL的EGF生長5 d，可見細胞排列緊密被一層膜包裹，形成上皮膜(見中插彩版圖1F)。

2.2 堿性磷酸酶染色 原代雞胚盲腸上皮細胞，經堿性磷酸酶染色呈棕黃色，在高倍顯微鏡下觀察，胞漿內可見棕色色素顆粒(見中插彩版圖2)。

2.3 EGF對雞胚盲腸上皮細胞增殖的測定結果 與不添加EGF組相比，EGF在10 ng/mL時，對雞胚盲腸上皮細胞的增殖有明顯的促進作用(P<0.01)，EGF在20 ng/mL時促增殖效果最明顯，且差異極其顯著(P<0.01)，在30 ng/mL時雞胚盲腸上皮細胞略有增長，但細胞增殖差異不顯著(P>0.05)，在40 ng/mL時，它的促增殖效果降低的非常明顯(P<0.01)，如圖3。

圖3 EGF對雞胚盲腸上皮細胞增殖的影響

注：圖中同一列數據大寫字母完全不同者為差異極顯著(P<0.01)

2.4 雞胚盲腸上皮細胞體外生長曲線測定 體外培養1-2 d的雞胚盲腸上皮細胞生長緩慢，第3天開始迅速生長，進入對數生長期，第4天達到峰值，第5天開始減緩，進入停滯期(圖4)。

圖4 雞胚盲腸上皮細胞生長曲線測定

3 討論

體外培養細胞培養基中添加生長因子對雞胚盲腸上皮細胞的生長發揮重要的作用。EGF在動物體液和組織中大量的存在，具有強大的生物學效應[14]。尤其是上皮細胞含量尤為豐富。EGF也在上皮細胞來源的細胞膜上大量分布，是上皮細胞的有效促有絲分裂劑，這是一個不爭的事實[15]。而EGF對上皮細胞增殖的焦點主要是體外培養時所選用的濃度。袁睿等[16]使用不同濃度的EGF(0、1、10、20、50 ng/mL)對人毛囊外毛根鞘無色素性黑素細胞增殖及遷移能力進行研究，結果表明，EGF濃度在20 ng/mL時，該細胞增殖和遷移能力最強。郭文平等[17]通過試驗證明,EGF的濃度為0.1～1 ng/mL時可以明顯的促進人角質細胞的增殖。在本試驗中，我們體外在細胞培養基中添加了不同濃度的EGF(0、10、20、30、40 ng/mL)作用72 h后，EGF在0～20 ng/mL隨其濃度的升高，促進雞胚盲腸上皮細胞增殖的效應也逐漸增加，但細胞呈散在的卵圓形。而EGF的濃度為20 ng/mL和30 ng/mL時，雞胚盲腸上皮細胞數量明顯增多，且呈現典型的鋪路石樣，而且細胞增殖效應最明顯，但是兩者之間差異不顯著(P>0.05)。當EGF的濃度為40 ng/mL時，觀察細胞生長較前兩濃度無明顯變化，但其促增殖的效應隨著濃度的升高會有所下降但仍比不添加EGF組高(P<0.01)。這與袁睿的觀點一致。筆者認為，20 ng/mL EGF能促進雞胚盲腸上皮細胞增殖，這主要于培養的來源組織有關，不同種屬的動物，細胞的生長環境不同，對生長因子的濃度也不同。

堿性磷酸酶是腸黏膜上皮細胞所特有的酶。該酶凝集于細胞表面，參與細胞內消化及其上皮細胞脫落到腸腔內的細胞外消化過程。因此可以用這種方法來鑒定體外培養的細胞是否為腸上皮細胞。古少鵬等[10]體外培養雞胚盲腸上皮細胞經堿性磷酸酶染色，結果為陽性，可判斷是盲腸上皮細胞。范斌等[18]對新生家兔空腸上皮細胞進行堿性磷酸酶染色為陽性，鑒定為兔結腸上皮細胞。楊文平等[19]體外培養至11 d的雞小腸上皮細胞堿性磷酸酶染色呈強陽性。賈國東等[20]原代分離培養的雞小腸上皮細胞進行堿性磷酸酶染色呈陽性。在本試驗中培養的雞胚盲腸上皮細胞進行堿性磷酸酶染色，結果呈陽性，這個結果與以前的研究結果相同，所以可以鑒定本試驗中培養的細胞為雞胚盲腸上皮細胞。

4 結論

本試驗結果表明，一定濃度范圍內的EGF對雞胚盲腸上皮細胞有促進增殖生長的作用，當濃度升高，其增殖作用明顯降低。從細胞形態學、生長曲線和堿性磷酸酶鑒定上與前人研究的腸上皮一致，符合腸上皮細胞的生長規律。本試驗中在體外細胞培養基中添加20 ng/mL EGF對該細胞增殖有促進作用，為構建雞胚盲腸上皮細胞系奠定了一定的基礎。