H7N9亞型禽流感油乳滅活疫苗誘導雞鴨鵝產生HI抗體的試驗

張濟培，曹夢蕊，張溢珊，李榮旭，劉佑明，劉敏芳，陳濟鐺，陳建紅

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231)

自2013年我國首次出現H7N9新型禽流感病毒以來，H7N9亞型禽流感在我國多地出現流行，隨著病毒的進化，病毒從對禽表現為不致病或低致病性轉變為高致病性，2017年3月，湖南地區出現由高致病性H7N9亞型禽流感病毒引起大量雞死亡的病例[1]。此外，據報道，H7N9亞型禽流感病毒可以直接感染人[2-3]。可見控制H7N9亞型禽流感病毒的流行對保護禽類健康和保障公共衛生安全具有雙重意義。目前H7N9亞型禽流感疫苗正處在應用推廣階段，為了有效防控H7N9亞型禽流感，本試驗采用H7N9亞型流感滅活疫苗，對雛雞、雛番鴨和雛鵝3種有代表性的禽種，進行3種程序的免疫試驗，檢測HI抗體變化情況，企望了解本疫苗對該幾種禽的免疫原性，及篩選出適合該禽類的免疫劑量、免疫次數等指標，為H7N9亞型流感滅活疫苗的應用提供具體的參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡非免疫雛雞(下簡稱C)，購自佛山市高明區某種雞養殖場；1日齡非免疫番鴨(下簡稱DF)，購自佛山市順德區某種番鴨養殖場；1日齡非免疫鵝(下簡稱G)，購自肇慶市高要區某種鵝養殖場。所有雛禽嚴格隔離飼養至2周齡，待試。

1.2 試劑器材 H7N9亞型禽流感油乳滅活疫苗(下簡稱H7N9油苗)及其HI抗原，由華南農業大學禽病實驗室提供；pH值7.2的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水，1%公番鴨紅細胞懸液，1%公雞紅細胞懸液，按常規配制。

1.3 方法

1.3.1 試驗動物分組與處理 2周(14日)齡雛雞44只，隨機分成C1、C2、C3、C4共4組，11只/組。C1-C3組采用H7N9油苗肌肉注射接種，其中C1組為“2周齡0.3 mL /只”免疫組(免疫程序1)；C2組為“2周齡0.5 mL /只”免疫組(免疫程序2)；C3組為“2周齡0.3 mL/只，3周齡0.6 mL/只”免疫組(免疫程序3)；C4組為非免疫組。各組分別于接種前(接種當天)和接種后每周經靜脈采血，分離血清標記，-20 ℃保存，統一按常規做H7N9亞型流感HI抗體效價檢測。2周齡雛番鴨44只，2周齡雛鵝44只，其分組、免疫接種及采血安排與上述雛雞一致。

1.3.2 各種雛禽H7N9亞型流感HI抗體檢測方法 血凝抑制試驗(HI)微量法，參照《高致病性禽流感疫情處置技術規范(試行)(2004)》及朱燕秋等“水禽禽流感 H5N1 抗體檢測方法”進行[4-5]。對雞的血清，采用1%成年公雞源紅細胞懸浮液作 HI 試驗；對番鴨和鵝的血清，采用1%成年公番鴨源紅細胞懸浮液作 HI 試驗。

2 結果

2.1 各種雛禽各組H7亞型流感HI抗體檢測情況 見表1。

表1 各種雛禽各組H7N9亞型禽流感 HI 抗體(Log2)檢測情況及各周(W)均值

2.2 雛雞各組H7N9亞型禽流感HI抗體比較的情況 由表1中C1-C3組H7N9亞型禽流感HI抗體檢測結果可見，雛雞應用 H7N9 油苗，采取3種方式免疫，免疫后各周均值以 C1 組最低(3.66 Log2)，最初2周及最后1周低于4.00 Log2；C2 組各周 HI 抗體均值中等(4.09 Log2)，仍然是最初2周及最后1周低于4.00 Log2；C3 組各周 HI 抗體均值最高(4.46 Log2)，只有最初1周低于4.00 Log2。

2.3 雛番鴨各組H7N9亞型禽流感HI抗體比較情況 由表1中DF1-DF3組H7N9亞型禽流感HI抗體檢測結果可見，雛番鴨應用 H7N9 油苗，采取3種方式免疫，免疫后各周均值以 DF1 組最低(4.96 Log2)，DF2 組、DF3 組各周 HI 抗體均值相近(6.37 Log2，6.31 Log2)，顯著高于DF1 組。另外可見，3組均只有免疫后最初1周低于4.00 Log2。

2.4 雛鵝各組H7N9亞型禽流感HI抗體比較的情況 由表1中G1-G3組H7N9亞型禽流感HI抗體檢測結果可見，雛鵝應用 H7N9 油苗，采取3種方式免疫，免疫后各周均值以 G1 組最低(4.44 Log2)，最初3周低于4.00 Log2；G2 組各周 HI 抗體均值中等(5.02 Log2)，最初3周低于4.00 Log2；G3 組各周 HI 抗體均值最高(5.60 Log2)，最初2周低于4.00 Log2。

2.5 各種雛禽同方式免疫組H7亞型禽流感HI抗體比較情況 由表1可見，以免疫程序1接種H7N9油苗，HI 抗體產生情況最好的是番鴨(抗體水平上升較快，峰值平穩維持時間較長)；次之為雛鵝(抗體水平上升較慢，但持續維持上升狀態)，再次為雛雞(抗體水平上升較慢，峰值維持時間較短)。

由表1可見，以免疫程序2接種H7N9油苗，HI抗體產生情況最好的是番鴨(抗體水平上升快速，并呈持續上升趨勢)；次之為雛鵝(抗體水平上升較慢，各周均低于雛番鴨，但有持續上升趨勢)，再次為雛雞(抗體水平上升較慢，峰值維持時間較短)。

由表1可見，以免疫程序3接種 H7N9油苗，以雛番鴨產生的HI 抗體較好；次之為雛鵝，再次為雛雞。

2.6 各種雛禽各免疫組H7N9亞型禽流感HI抗體均值比較情況 由表1可見，以各種雛禽各免疫組抗體均值作比較，進一步顯示，以 H7N9 油苗免疫誘導 HI 抗體反應，最好為雛番鴨，其次為雛鵝，再次為雛雞；免疫接種方式，雛雞和雛鵝，以3組優于2組，2組優于1組；雛番鴨，以3組、2組免疫效果較好而優于1組。

3 討論

自2017年3月份在湖南永州發生H7N9亞型禽流感后，陸續報道在河北、河南、天津、陜西等地發生H7N9亞型禽流感疫情，引起大量雞只死亡，造成經濟損失[6]。同時，H7N9亞型禽流感于2013年首次報道感染人以來，波及范圍不斷擴大，造成全國多地區人感染發病、死亡[7]。可見H7N9亞型禽流感病毒不僅在動物經濟方面造成影響，且對人類健康也存在威脅，因此加強H7N9禽流感的防控具有深刻的意義。

本試驗采用H7N9油乳滅活疫苗，對雛雞、雛番鴨和雛鵝進行免疫試驗。結果表明，本疫苗對3種雛禽都具有良好的免疫原性。但禽的品種不同，接種劑量及次數不同，誘導產生HI抗體的強度亦有不同。據各種雛禽各免疫組抗體均值作總體評價，反應效果最好為雛番鴨，其次為雛鵝，再次為雛雞；同種禽類不同程序之間評價，在雛雞和雛鵝，以程序3優于程序2，程序2優于程序1；在雛番鴨，以程序3與程序2較好，優于程序1。

雛雞免疫2周后HI抗體達到4.00 Log2，免疫后各周均值可達4.46 Log2；雛番鴨免疫2周后HI 抗體達到4.91 Log2，免疫后各周均值可達到6.37 Log2；雛鵝免疫3周后HI 抗體達到4.55 Log2，免疫后各周均值可達到5.60 Log2。張濟培等[8]在番鴨作H5N1亞型禽流感的免疫保護試驗，在人工感染的情況下，表明HI抗體在4 Log2時，大部分番鴨可以抵抗病毒感染，小部分仍然有發病，HI抗體在6 Log2或以上時，所有番鴨均可抵抗病毒感染。姜北宇等[9]也報道，采用H5亞型禽流感疫苗免疫，當抗體HI≥6 Log2時，保護率達100%，免疫動物能抵御禽流感強毒的攻擊。提示，如果以4 Log2為免疫保護臨界滴度，則為了使免疫雛禽獲得盡可能好的保護，對于雛雞和雛鵝應采用程序3免疫接種，對于雛番鴨，則可優先選用程序3和程序2。不同品種、不同用途的家禽可根據飼養時間的不同，選取適合的免疫程序。可以根據對免疫禽群的免疫監測動態結果，來適當調整免疫程序。