禽腺病毒-I群、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒多重PCR檢測方法的建立

江之瑤，王欣慧，王守春，欒慶東,王建琳，尹燕博

(青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109)

禽腺病毒-I群(Fowl adenovirus,FAV-I)，屬于腺病毒科，包括12個血清型(血清1-8a， 8b-11)，FAV-Ⅰ可引起雞包涵體肝炎、心包積液綜合征、再生障礙性貧血等癥狀[1]。臨床FAV-I感染的調查結果表明，我國主要流行血清4型、8a型、8b型和11型[2]，其中血清4型FAV-I自2014年以來，給我國肉雞給養殖業造成了巨大損失[3]。

自2007年以來，青島農業大學預防獸醫學實驗室對我國部分地區臨床FAV-I感染流行病學研究結果顯示，2007年到2014年6月，我國主要流行血清11型FAV-I，該血清型病毒主要引起雞包涵體肝炎；2014年7月到2016年，我國主要流行血清4型FAV-I，該血清型病毒主要引起雞心包積液綜合征；自2017年以來，主要流行血清8b型FAV-I，該血清型病毒主要引起雞包涵體肝炎[2,4]。調查結果顯示，臨床FAV-I往往與其他病原混合感染，常見的有新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)、H9亞型禽流感病毒(AIV-H9)和大腸桿菌[4]，鑒于臨床以上病原的混合感染，本研究擬建立針對FAV-I、NDV和IBV的多重PCR檢測方法，可用于快速檢測并區分這 3 種病毒。

1 材料與方法

1.1 毒株 試驗所用AIV-H9(C/SD/196/11株)、NDV (LaSota株)、IBV(M41株)、FAV-I(FAV-4)、CIAV、Ⅲ群禽腺病毒(EDSV)、馬立克病毒(MDV)為本實驗室鑒定保存毒株。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus，購自TaKaRa公司；M-MLV反轉錄酶、5×Buffer 、RNA酶抑制劑、2×Mix、隨機引物等,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成 根據GenBank中登陸的FAV-I的Hexon基因、NDV的F基因和IBV 的N基因分別設計了3對特異性引物(表1)，由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

表1 FAV-I、NDV和IBV檢測用引物序列

1.3.2 病毒核酸的提取與反轉錄 取1.5 mL離心管，加入700 μL RNAiso Plus后加入200 μL組織研磨液，吹打混勻，-20 ℃靜止10 min，加入140 μL氯仿，渦旋混勻，室溫靜置3 min。12 000 r/min離心15 min。取上清液550 μL，與500 μL異丙醇混勻，-20 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清液。加入1 000 μL 75%冰乙醇，7 500 r/min離心5 min，棄上清液，反復2次。將離心管口敞開，在室溫中干燥。干燥徹底后加入20 μL反轉錄體系(RNasefree H2O 11 μL、 5×Buffer 4 μL、 dNTPs 2 μL、 M-MLV 1 μL 、Inhibitor 0.5 μL、 隨機引物 1.5 μL),輕彈離心管底部，使核酸充分溶解。42 ℃水浴1 h后，反轉錄為cDNA，-70 ℃保存。

1.3.3 反應條件優化 取FAV-I、NDV 和IBV 的cDNA，單項擴增后將PCR產物測序后構建質粒。在單項PCR反應條件基礎上，建立多重PCR方法，并對其反應條件(退火溫度、引物濃度)進行優化，確定最佳反應條件。

1.3.4 特異性和敏感性試驗 應用優化后的多重PCR分別對EDSV、 MDV、 CIAV和 AIV-H9進行特異性檢驗。

將用FAV-I、NDV 和IBV擴增產物構建的質粒導入感受態細胞中并培養擴繁，提取質粒后測定其濃度并計算拷貝數。將提取出的質粒10倍比稀釋作為模板，進行敏感性試驗。

1.3.5 臨床病料檢測 取送檢的疑似FAV-I感染病死雞的肝臟、腎臟等臟器，加入5倍量生理鹽水后勻漿。反復凍融3次后離心取上清液，提取核酸。用單項PCR和本試驗建立的多重PCR進行檢驗。

2 結果

2.1 單項PCR建立 反應體系：2×Master Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL；擴增程序：95 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、55 ℃(IBV 57 ℃、NDV 56 ℃)40 s、72 ℃ 1 min 20 s、35個循環，72 ℃ 10 min。FAV、IBV和NDV 均能擴增出預計條帶，大小分別為894 bp、529 bp和1 600 bp(見圖1)，擴增產物經測序，且結果正確。

2.2 多重PCR建立

2.2.1 退火溫度確定 擴增程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，退火溫度40 s，72 ℃ 1 min 20 s，35個循環，72 ℃ 10 min。退火溫度設置為47～57 ℃(見圖2)。試驗確認，退火溫度為55 ℃時，擴增效果最好且沒有干擾。

圖1 FAV、NDV和IBV單項PCR擴增結果

M: DNA Marker DL-2 000 ; 1: NDV ; 2: FAV-I ; 3: IBV

圖2 FAV-I、NDV和IBV多重PCR退火溫度的優化

M: DNA Marker DL-2 000 ; 1: 47 ℃ ; 2: 48.2 ℃ ; 3: 49.5 ℃ ; 4: 50.7 ℃ ; 5: 52.5 ℃ ; 6: 54.1 ℃ ; 7: 55.7 ℃ ; 8: 57 ℃

2.2.2 引物濃度確定 經過對FAV-I、NDV、IBV單項及多重PCR引物濃度、退火溫度等條件的優化，最終確認多重PCR反應體系：2×Master Mix 12.5 μL、模板 2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL；擴增程序：95 ℃預變性5 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min 20 s、共計35個循環，72 ℃終延伸10 min。FAV-I、NDV和IBV的引物濃度分別為3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL。

2.3 特異性檢測 提取實驗室保存的毒株FAV-I、NDV、IBV、EDSV、MDV、CIAV和AIV-H9的核酸，后經反轉錄，按照已確認的多重PCR條件進行擴增。其中FAV-I、NDV、IBV均可擴增出與預期一致的條帶，而EDSV、MDV、CIAV和AIV-H9均無特異性條帶(見圖3)。

圖3 FAV-I、NDV和IBV多重PCR特異性試驗

M: DNA Marker DL-2 000 ; 1: FAV-I+NDV+IBV ; 2: EDSV ; 3: MDV ; 4: CIAV ; 5: AIV-H9

2.4 敏感性檢測 將已擴增出的FAV-I、NDV、IBV目的條帶切膠回收，連接pMD19-T質粒后導入感受態細胞中。經37 ℃搖菌擴繁8 h，用質粒提取試劑盒提取質粒。測定質粒濃度為FAV-I 165.3 ng/μL、NDV 93 ng/μL、IBV 293.2 ng/μL經換算得出拷貝數為FAV-I 4.27×1010拷貝/μL、NDV 2.68×1010拷貝/μL、IBV 6.33×1010拷貝/μL。將質粒10倍比梯度稀釋后作為模板，經多重PCR檢測得出該方法中FAV-I、NDV和IBV的最低檢測限分別為： 1.46×105拷貝/μL、8.93×102拷貝/μL和2.11×104拷貝/μL(見圖4)。

圖4 FAV-I、NDV和IBV多重PCR敏感性試驗

M: DNA Marker DL-2 000 ; 1:100倍稀釋 ; 2: 101倍稀釋 ; 3: 103倍稀釋 ; 4: 104倍稀釋 ; 5: 105倍稀釋 ; 6: 106倍稀釋 ; 7: 107倍稀釋 ; 8: 108倍稀釋

2.5 臨床病料檢測 從各地收集到有明顯病變的病料17份，提取核酸后反轉錄分別多重PCR和單項PCR分別檢測。多重PCR檢測結果為：陰性2份、IBV 2份、FAV-I 7份、NDV 3份、FAV-I+IBV 3份，與單項PCR結果相同(見圖5)。

圖5 FAV-I、NDV和IBV多重PCR對臨床樣品的檢測結果

M: DNA Marker DL-2 000 ; 1-17: 臨床樣品

3 討論

建立多重PCR方法的關鍵是引物的選擇，在設計引物時要同時考慮各引物之間、引物與模板之間的關系；既要保證擴增的效率；又要盡可能的降低引物二聚體和非特異性擴增，還要考慮擴增條帶之間可以明顯區分和退火溫度的一致[5]。在本研究中，3對引物均設計在模板的保守區，有良好的特異性且互相之間沒有干擾；且3對引物的擴增片段為大小分別為894 bp、529 bp和 1600 bp，每對的擴增片段長度差均大于100 bp，具有明顯的區分度，可使擴增產物在凝膠成像時有良好的區分度。在退火溫度的選擇上，本研究在退火溫度梯度PCR中顯示54～57 ℃擴增過程無干擾且擴增效果良好，根據研究報道[6]及實驗室的習慣，本研究的退火溫度選用比較通用的55 ℃。

FAV-I所包括的12 個血清型毒株中，其Hexon基因作為分型的重要研究對象，雖然毒株序列存在著一定的差異，但也具有有很高的保守性[7]，根據其Hexon基因的保守區設計引物，可全部擴增12個血清型，且通過擴增產物測序來區分不同的血清型[2,4]。我國自2014年開始大規模暴發FAV-I，其中在我國的流行血清型為血清4、8a、8b、11型，且這幾種血清型雖然部分毒株之間具有一定的交叉反應性[2]，但毒株之間不能完全的交叉保護[8]，表明我國FAV-I流行具有多種血清型，且可能存在多種血清型同時感染的可能；鑒于血清4型FAV-I感染造成肉雞大量死亡，故本研究通過Hexon基因的保守區設計引物以擴增FAV-I的全部血清型毒株，以血清4型FAV-I為代表進行了FAV-I的檢測研究。

IBV的基因組為不分階段的單股正鏈RNA，NDV的基因組為不分階段的單股負鏈RNA，而FAV-I的基因組為線狀雙鏈DNA。在核酸提取過程中，本研究將所有病毒都視為RNA病毒提取核酸并進行了反轉錄，試驗表明，FAV-I的DNA在經過反轉錄后依然可以有效擴增。FAV-I的基因組為線狀雙鏈DNA，有良好的穩定性，在42 ℃時，不會被破壞、降解，均能被檢測到。

本研究建立的多重PCR能且只能準確的擴增出FAV-I、NDV、IBV的特異條帶，表明多重PCR方法有對FAV-I、NDV、IBV有良好的特異性。本多重PCR方法能檢測出FAV-I 1.46×105拷貝/μL、NDV 8.93×102拷貝/μL、IBV2.11×104拷貝/μL，表明本方法有良好的敏感性，但3種病毒的檢測限各不相同，是因為各引物的結合能力有差異且最佳退火溫度有細微差別。在臨床樣品檢測結果表明，本方法與單項PCR檢測結果一致，能夠滿足臨床樣品檢測的要求。

本研究建立的FAV-I、NDV、IBV多重PCR方法可同時檢測出這3種病毒，且能進行鑒別，該方法具有較高的特異性、敏感性和穩定性，可為臨床該3種病毒的檢測提供重要的依據。