中藥復方對腹水綜合征肉雞心肺SIRT1、PGC-1α的作用

王 卓，趙冬冬，郭宇榮，楊 瀾，溫 爽，申偉祺，程 佳，孫耀貴，王文魁，段智變

(山西農業大學動物科技學院，山西 太谷 030801)

肉雞腹水綜合征(Ascites syndrome,AS)是一類非傳染性、營養代謝性疾病，主要臨床癥狀包括腹水、右心肥大、肺和肝充血腫大，缺氧是誘發AS的主要原因[1]。缺氧刺激肺部血管收縮、重構，肺動脈壓力升高，右心負荷增加，促進右心代償性肥大直至衰竭，肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)和心臟衰竭(Heart failure,HF)是AS的主要病理環節[1]。缺氧下活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)大量產生，刺激細胞凋亡發生異常，造成組織器官損傷，促進疾病的形成[2-3]。

信息沉默調節因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)在機體中廣泛表達且具有高度保守性，調節缺氧、氧化應激、凋亡等多種細胞生命活動[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α(PPARY coactirator-1α,PGC-1α)是SIRT1的下游因子，調節與抗氧化、線粒體功能相關基因的表達[4]。研究顯示，缺氧環境會導致SIRT1和PGC-1α表達及活性降低，激活SIRT1可以增加心和肺對缺氧的抗性[3-5]。

課題組前期研究結果表明，復方中藥通過保護血管功能、抑制肝纖維化有效防治AS[6-8]，研究表明，黃芪、當歸、丹參等中藥能增加SIRT1表達，抵抗氧化應激，抑制細胞凋亡[9-12]，因此，本試驗采用課題組前期造模方法復制肉雞腹水綜合征模型，通過測定35日齡AS肉雞心肺組織中SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白含量和血清總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量，研究肉雞腹水綜合征的發病機理以及中藥復方的防治機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 健康1日齡羅斯肉雞304羽(雌雄不限)及三段式喂養，飼料購自山西文水縣大象禽業有限公司。

1.2 中藥復方湯劑制備 采用課題組前期試驗方法[6-8]，主要中藥黃芪、當歸、丹參、茯苓、大腹皮組方配比為3 ∶2 ∶2 ∶2 ∶1，清水浸泡30 min后煎煮40 min，紗布過濾，收集藥液，重復3次，合并藥液減壓蒸餾濃縮至1 g/mL，-20 ℃保存備用，飼喂前溫化處理。

1.3 主要化學試劑及儀器設備 石蠟切片機(上海躍進醫療器械廠產品)，倒置熒光顯微鏡(IX81-F72FL/PH，日本Olympus公司)，雞SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白ELISA檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)，酶標分析儀(RT-6100，美國Rayto公司)，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所)，丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 肉雞腹水綜合征模型復制與樣本采集 采用本課題組多因素法[6-8]復制肉雞AS模型，肉雞常規育雛飼養至7日齡，隨機分為5組：對照組、模型組、中藥復方高、中、低劑量組(各組飼養條件見表1)。35日齡時，每組隨機抽取10羽肉雞，空腹心臟采血，室溫靜置2 h，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液即為血清；頸動脈放血處死肉雞后，剖檢并觀察病理變化，取部分右心室和肺組織制作病理切片，部分右心室和肺組織于冰冷生理鹽水中緩慢沖洗，洗凈后用潔凈濾紙吸干，稱重，按質量 ∶體積=1 ∶9加入生理鹽水，用勻漿機制備組織勻漿，3 000 r/min離心20 min，取上清液。

表1 試驗分組、藥物劑量及飼養方式

1.5 心、肺組織病理學觀察 取肉雞右心室和左側肺下方部分組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規切片(5 μm)，H.E.染色觀察病理學變化。

1.6 心、肺組織蛋白含量檢測 按試劑盒說明書以ELISA方法檢測心或肺組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量。

1.7 血清相關指標檢測 按說明書對樣品預處理，采用黃嘌呤氧化酶法檢測肉雞血清T-SOD活性，采用硫代巴比妥酸法檢測肉雞血清MDA含量。

2 結果

2.1 臨床癥狀和剖檢變化 AS肉雞精神沉郁，羽毛雜亂，腹部脹滿，呼吸困難。剖檢病雞可發現腹腔內有大量透明黃色液體；心包積液，右心室壁薄、質軟、擴張；肺水腫淤血；肝體積腫大，顏色發暗，有黃色沉積物；腎臟充血腫大，部分有白色沉積物。與模型組相比，中藥復方高、中、低劑量組肉雞臨床癥狀和剖檢變化均有改善。

2.2 肉雞心組織病理學變化 結果表明(見中插彩版圖1)，35日齡時，對照組肉雞心組織細胞排列有序，大小均勻，結構完整；與對照組相比，模型組心肌細胞結構紊亂，連接疏松，交錯排列，肌纖維呈波浪狀，細胞核增大、濃染，結締組織增生，可見炎性細胞浸潤；與模型組相比，中藥復方高、中、低劑量組心組織細胞結構、形態均有不同程度改善。

2.3 肉雞肺組織病理學變化 結果表明(見中插彩版圖2)，35日齡時，對照組肺組織細胞結構清晰、完整，細胞排列整齊；與對照組相比，模型組肺組織結構疏松，被膜增厚，炎性細胞浸潤，肺小動脈充血，副支氣管平滑肌層萎縮、管腔中大量紅細胞滲出，肺毛細管萎縮、狹窄、破裂；與模型組相比，中藥復方高、中、低劑量組肺組織細胞結構較完整，肺小動脈內皮細胞、平滑肌細胞排列有序，副支氣管平滑肌層結構良好、管腔中紅細胞滲出減少，肺毛細血管結構較完整，但仍有大量炎性細胞浸潤。

2.4 心組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量 由表2結果表明，35日齡時，與對照組相比，模型組肉雞心組織SIRT1、PGC-1α和Bcl-2蛋白含量極顯著降低(P<0.01)，Bax蛋白含量極顯著升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，中藥復方高、中、低劑量組肉雞心組織SIRT1、PGC-1α和Bcl-2蛋白含量極顯著或顯著升高(P<0.01或P<0.05)，Bax蛋白含量極顯著或顯著降低(P<0.01或P<0.05)，Bcl-2/Bax比值極顯著升高(P<0.01)；中藥復方高、中、低劑量組間肉雞心組織SIRT1和PGC-1α蛋白含量無顯著差異(P>0.05)；與中藥復方低劑量組相比，中藥復方高劑量組肉雞心組織Bcl-2蛋白含量顯著升高(P<0.05)；與中藥復方低劑量組相比，中藥復方高、中劑量組肉雞心組織Bax蛋白含量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)。

表2 中藥復方對肉雞心組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量的影響

注：同行數據右角所標字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);下表同

2.5 肺組織SIRT1、PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量 由表3結果表明，35日齡時，與對照組相比，模型組肉雞肺組織SIRT1、PGC-1α和Bcl-2蛋白含量極顯著降低(P<0.01)，Bax蛋白含量極顯著升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，中藥復方高、中、低劑量組肉雞肺組織SIRT1、PGC-1α和Bcl-2蛋白含量極顯著或顯著升高(P<0.01或P<0.05)，Bax蛋白含量極顯著或顯著降低(P<0.01或P<0.05)，Bcl-2/Bax比值極顯著或顯著升高(P<0.01或P<0.05)；與中藥復方低劑量組相比，中藥復方高、中劑量組肉雞肺組織SIRT1蛋白含量顯著升高(P<0.05)；中藥復方高、中、低劑量組間肉雞肺組織PGC-1α、Bcl-2和Bax蛋白含量以及Bcl-2/Bax比值無顯著差異(P>0.05)。

指標對照組模型組中藥復方高劑量組中藥復方中劑量組中藥復方低劑量組SIRT1 (ng/g)92.83±3.95Aa66.02±9.72Bc90.38±5.97Aa90.95±6.06Aa79.55±9.52AbPGC-1α (nmol/g)0.796±0.057Aa0.579±0.062Cc0.756±0.046ABab0.740±0.051ABab0.686±0.067BbBcl-2 (pg/g)458.91±23.43Aa347.56±44.30Bc427.88±30.92Aab420.16±20.68Aab406.56±28.21AbBax (ng/g)21.05±1.17Cc27.54±2.25Aa23.08±2.14BCbc23.55±1.11BCb24.57±1.57ABbBcl-2/Bax1.004±0.096Aa0.587±0.130Cc0.856±0.095ABb0.821±0.074ABb0.764±0.096BCb

2.6 血清T-SOD活性和MDA含量 由表4結果表明，35日齡時，與對照組相比，模型組肉雞血清T-SOD活性極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，中藥復方高、中、低劑量組肉雞血清T-SOD活性極顯著或顯著升高(P<0.01或P<0.05)，MDA含量極顯著或顯著降低(P<0.01或P<0.05)；中藥復方高、中、低劑量組間肉雞血清T-SOD活性差異不顯著(P>0.05)；與中藥復方低劑量組相比，中藥復方高劑量組肉雞血清MDA含量顯著降低(P<0.05)。

指標對照組模型組中藥復方高劑量組中藥復方中劑量組中藥復方低劑量組T-SOD (U/mL)233.51±14.76Aa191.19±14.83Bb226.29±15.59Aa226.20±20.13Aa220.60±19.37ABaMDA (nmol/mL)2.871±0.193Cd4.142±0.193Aa3.514±0.197Bc3.602±0.285Bbc3.840±0.132ABb

3 討論

研究表明，肉雞腹水綜合征實驗模型構建方法有低溫誘發法、高鈉誘發法、飼喂高能飼料法、低壓艙缺氧誘發法、單側肺動脈結扎法等，本試驗復制課題組前期多因素法構建的肉雞腹水綜合征模型[6-8]，AS肉雞出現典型的腹水癥狀。研究表明，AS肉雞心肺都有嚴重的病理損傷，且早于腹水形成，肺小葉毛細血管淤血，支氣管擴張或狹窄，心肌細胞變性、壞死，細胞間毛細血管充血、出血，炎性細胞浸潤和結締組織增生[13]，表明心肺損傷和功能障礙影響氣體交換，引起缺氧，增加心臟負荷，右心代償性肥大進而失去代償直至衰竭，導致全身血液循環障礙，加重組織廣泛病變，參與AS發生發展，與本試驗結果相符。

ROS是氧代謝的副產物。缺氧環境導致細胞ROS不斷積累，與脂質發生過氧化反應，生成大量MDA；缺氧和氧化應激下細胞凋亡異常，促進疾病發生發展[2-3,14]。Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax可誘導細胞凋亡，Bcl-2/Bax比值可綜合反映細胞凋亡狀態[2]。研究表明，AS肉雞肝組織MDA含量顯著增加[14]；高水平ROS導致心肌細胞凋亡，引發心臟功能障礙和HF[15]；誘導SOD表達，能清除過量ROS，延緩細胞衰老，抑制血管疾病[14-15]；短期缺氧刺激心肌細胞抵抗凋亡，長期缺氧引起心室壁增厚、結構異常以及心肌細胞凋亡[16]；6 h和12 h缺氧激活肺上皮細胞Bcl-2促進細胞增殖，24 h和48 h缺氧則激活Bax引發細胞凋亡[17]。本試驗結果顯示，35日齡模型組AS肉雞心肺組織Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達增高，Bcl-2/Bax比值顯著降低，抗氧化能力降低，參與并誘導AS發生發展。

SIRT1屬于NAD+依賴型脫乙酰化酶，在缺氧、氧化應激、慢性炎癥等相關疾病中發揮重要作用[3]。激活SIRT1調節其下游靶蛋白PGC-1α起始和持續反應，通過增加Mn-SOD、過氧化氫酶(Catalase,CAT)等抗氧化蛋白表達和線粒體生物學功能，可緩解或治療PAH和HF[3-5]。研究表明，AS肉雞肺組織血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表達增加[7]；SIRT1能抑制缺氧下VEGF的表達，抑制血管增殖[3]；但在缺氧環境下，多種因素導致SIRT1下調使其保護作用受到限制[3]。本試驗結果顯示，35日齡模型組AS肉雞心肺組織SIRT1、PGC-1α蛋白表達顯著降低，說明機體對缺氧環境的保護作用降低，導致AS發生發展。

中獸醫學分析AS證候為氣血雙虛、氣滯血瘀、水濕停聚，本試驗所用中藥復方具有氣血雙補、活血行氣、利水滲濕的功效[6-8]。研究表明，黃芪可補氣升陽、益氣固表、利水消腫；黃芪甲苷和黃芪皂苷IV可以激活SIRT1/PGC-1α信號通路，增加SOD活性，減少MDA含量，增加Bcl-2/Bax比值，保護細胞免受氧化損傷、抑制凋亡[9-10]。當歸可補血活血、養血潤燥；黃芪和當歸組方可上調SIRT1表達，降低急性心肌梗死的細胞凋亡和纖維化，抵抗心肌肥厚[11]。丹參可活血祛瘀、涼血消癰；丹參酮IIA通過激活SIRT1，保護心肌細胞免受低氧損傷，抗心肌肥厚，緩解HF，防治AS[12,18]。茯苓可健脾滲濕；茯苓和黃芪等組方能改善小鼠心肌能量代謝，減輕氧化損傷[19]。大腹皮可行氣寬中、行水消腫，是肝硬化腹水中常用中藥[20]。本試驗結果顯示，中藥復方能增加35日齡肉雞心肺SIRT1和PGC-1α蛋白表達，上調心肺Bcl-2表達、下調Bax表達，Bcl-2/Bax比值顯著升高，增加血清T-SOD活性、減少MDA含量，表明中藥復方通過激活SIRT1和PGC-1α，增加肉雞抗氧化能力，減少氧化損傷和心肺細胞凋亡異常，有效防治AS。