晉北 晉中 晉南地區(qū)冬季舍飼羊場(chǎng)真菌氣溶膠差異分析

張艷冰，郭 耀，喬婷婷，白燕雨，劉佳琪，段晉偉，高曉莎，于 歡，唐 芳，霍乃蕊，古少鵬

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

畜禽養(yǎng)殖過程中不斷產(chǎn)生真菌氣溶膠并向周圍環(huán)境擴(kuò)散，對(duì)畜禽和養(yǎng)殖人員健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。真菌粒子進(jìn)入呼吸道或定殖于體內(nèi)，使人畜免疫力降低，誘發(fā)真菌性肺炎、皮膚感染、過敏性哮喘、真菌毒素中毒等疾病[2-4]。微生物氣溶膠受多種因素影響，主要與氣象狀況、飼養(yǎng)管理和養(yǎng)殖環(huán)境等有關(guān)，且其危害程度與微生物種類、濃度和氣載微生物粒徑密切相關(guān)[5-6]。氣溶膠是養(yǎng)殖場(chǎng)真菌性疾病的主要傳播途徑，尤其是在現(xiàn)代化的畜禽養(yǎng)殖中，真菌性疾病多發(fā)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，目前雞舍、兔舍、豬舍、鹿舍及奶牛舍真菌氣溶膠已進(jìn)行過較為系統(tǒng)的研究，有關(guān)羊場(chǎng)氣載真菌的研究鮮有報(bào)道[1，7-11]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場(chǎng)氣載微生物多來源于糞土，羊舍氣載真菌濃度高于封閉式的豬舍和雞舍，約80%的真菌氣溶膠粒子可以進(jìn)入人和動(dòng)物的肺泡，潛在威脅極大[12-13]。山西省是全國養(yǎng)羊大省，養(yǎng)殖集約化程度較高，冬天圈舍封閉，環(huán)境質(zhì)量差，疾病多發(fā)[14]，且全省南北跨度較大、氣候差異顯著，舍內(nèi)羊群密度、溫度、濕度及飼養(yǎng)模式均有差異，羊場(chǎng)氣載真菌種類、優(yōu)勢(shì)菌屬、真菌氣溶膠分布特點(diǎn)及危害程度均有待深入研究。本試驗(yàn)對(duì)晉北、晉中和晉南3個(gè)地區(qū)的9棟半封閉式羊舍氣載真菌的組成、濃度、粒徑分布、多樣性與相似性特征進(jìn)行了測(cè)定和分析，以期為羊場(chǎng)真菌氣溶膠危害評(píng)估和環(huán)境控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 羊場(chǎng)概況 于晉北、晉中、晉南各選取3棟規(guī)模相當(dāng)?shù)陌敕忾]式羊舍進(jìn)行樣品采集，結(jié)構(gòu)為單列式地面結(jié)構(gòu)；兩側(cè)墻壁設(shè)窗，屋頂設(shè)無動(dòng)力風(fēng)機(jī)，左側(cè)設(shè)過道，運(yùn)動(dòng)場(chǎng)位于舍外右側(cè)。羊場(chǎng)均以飼養(yǎng)湖羊?yàn)橹鳎雮€(gè)月清糞1次。

1.2 試劑及儀器 國際標(biāo)準(zhǔn)Andersen 6級(jí)空氣生物采樣器(Tisch environment，USA)，采樣介質(zhì)為虎紅氯霉素瓊脂(RBC-青島海博)；AGI-30液體采樣器(遼寧康潔)，采樣介質(zhì)為超純水(15 mL)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)；馬鈴薯葡萄糖肉湯(Solarbio，P9240)；真菌基因組DNA提取試劑盒(Solarbio，D2300)；ERIC-PCR引物(武漢塞維爾生物科技有限公司合成)；PCR擴(kuò)增儀(Bio-rad)；電泳儀(北京六一，DYY-6C)；凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 冬季采樣時(shí)間為8：00、12:00和17:00，采樣器高度距離地面50～70 cm，與羊的呼吸高度相近。Andersen 6級(jí)采樣器空氣流量為28.3 L/min，驅(qū)動(dòng)時(shí)間3 min。AGI-30采樣器空氣流量8 L/min，驅(qū)動(dòng)時(shí)間30 min[15]。每棟羊舍內(nèi)選取5個(gè)采樣點(diǎn)，每點(diǎn)每次3個(gè)重復(fù)。羊舍外環(huán)境樣本的采樣點(diǎn)為該羊舍上風(fēng)向100 m處,選取3個(gè)采樣點(diǎn)，每點(diǎn)每次3個(gè)重復(fù)。

采集對(duì)應(yīng)羊舍的糞土和飼草。測(cè)定并記錄每次采樣時(shí)的溫度、濕度和風(fēng)速。

1.3.2 樣品處理 Andersen 6級(jí)采樣器所采集真菌樣本于27 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，計(jì)算各級(jí)培養(yǎng)皿上的真菌菌落數(shù)(CFU)，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后再進(jìn)行一次校正計(jì)數(shù)[16]。將各地區(qū)重復(fù)采集的液體樣品混勻，分別取2 mL接種于4 mL加有雙抗(青霉素和鏈霉素)的馬鈴薯葡萄糖肉湯中，27 ℃振蕩培養(yǎng)3-5 d后提取DNA，用糞土、飼草制備的菌懸液提取DNA。

1.3.3 氣載真菌濃度測(cè)定 菌落計(jì)數(shù)校正后根據(jù)采樣流量和時(shí)間計(jì)算其濃度(CFU/m3)[13]，以濃度中值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4 真菌氣溶膠粒譜特征 各采樣點(diǎn)真菌氣溶膠粒譜特征以計(jì)數(shù)中值直徑(Count median diameter，CMD)表示，真菌粒徑分布的離散度以幾何標(biāo)準(zhǔn)差GSD表示[17]。人每分通氣量按6.94E-03 m3/min計(jì)算(10 m3/24 h)[18]、羊每分通氣量按5.70E-03 m3/min計(jì)算(8 m3/24 h)[19]。

1.3.5 可培養(yǎng)氣載真菌的分離鑒定 依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[20]、《醫(yī)學(xué)真菌學(xué)：實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指南》[21]和《獸醫(yī)真菌學(xué)》[22],對(duì)Andersen 6采樣器采集到的真菌進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)、乳酸酚棉藍(lán)染色、光學(xué)顯微鏡觀察，鑒別，并分析優(yōu)勢(shì)菌屬組成。

1.3.6 ERIC-PCR擴(kuò)增 ERIC引物序列P1為： 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC引物序列P2為： 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。反應(yīng)體系20 μL，含有：10×PCR Buffer(Mg2+plus) 2.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.6 μL，rTaqDNA polymerase(5 U/μL) 0.2 μL，引物(10 μmol/L) ERIC-1和ERIC-2各1.0 μL，DNA模板(100 ng/μL-1) 2.0 μL(對(duì)照用等量雙蒸水代替)，雙蒸水12.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性5 min；90 ℃變性30 s；52.5 ℃復(fù)性1 min；72 ℃延伸1 min(32個(gè)循環(huán))；最后72 ℃延伸8 min。產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照用于結(jié)果分析。

1.3.7 ERIC-PCR圖譜分析 使用Quantity One 4.6.2軟件對(duì)ERIC-PCR的指紋圖譜進(jìn)行UPGMA(Unweighted Pair Group Mean Average)聚類分析，計(jì)算其相似性指數(shù)，并構(gòu)建系統(tǒng)樹狀圖。將ERIC-PCR圖譜菌群條帶轉(zhuǎn)變?yōu)椴ǚ鍒D，用香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener Index， H′)和辛普森優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(Simpson Index， C)表示真菌多樣性：

H′=-∑(Pi)(lnPi)

C=∑Pi2

式中Pi=ni/N， ni為每個(gè)波峰的面積，N為波峰總面積[23]。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS Version 22.0和Microsoft Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)地區(qū)冬季舍飼羊場(chǎng)氣載真菌濃度 3個(gè)地區(qū)羊舍外環(huán)境的氣載真菌濃度水平由高到低依次為晉南(1 181±428 CFU/m3)、晉中(1 166±183 CFU/m3)和晉北(424±106 CFU/m3)，晉北顯著低于其他地區(qū)(P﹤0.05)。地區(qū)間羊舍內(nèi)環(huán)境真菌濃度差異不顯著(P>0.05)，舍內(nèi)氣載真菌濃度均顯著高于舍外(P﹤0.05)，為舍外的2.1～9.4倍。

2.2 3個(gè)地區(qū)舍飼羊場(chǎng)真菌氣溶膠粒譜特征

2.2.1 真菌氣溶膠粒徑分布 羊舍內(nèi)、外環(huán)境中氣載真菌均集中分布在采樣器的Ⅲ～Ⅴ級(jí)(0.65～4.7 μm)，其中外環(huán)境Ⅲ～Ⅴ級(jí)占比從高到低依次為晉南(88.9%)、晉中(87.1%)和晉北(86.2%)；舍內(nèi)為晉南(74.0%)、晉中(70.3%)和晉北(63.4%)。峰值均出現(xiàn)在第Ⅳ級(jí)(2.1～3.3 μm)，次峰均在Ⅴ級(jí)(1.1～2.1 μm)。見圖1。

圖1 各地區(qū)氣載真菌粒徑分布

2.2.2 真菌氣溶膠粒子CMD和GSD值 3個(gè)地區(qū)羊舍外環(huán)境的真菌氣溶膠粒子CMD均值由高到低依次為：晉北(2.60 μm)、晉中(2.58 μm)和晉南(2.50 μm)；粒徑分布離散度(GSD)為：晉南(2.16)、晉中(2.11)和晉北(2.10)；羊舍內(nèi)真菌氣溶膠粒子CMD均值由高到低依次為：晉北(2.67 μm)、晉中(2.52 μm)和晉南(2.5 μm)；粒徑分布離散度(GSD)為：晉南(2.06)、晉中(2.02)和晉北(2.00)。

2.2.3 真菌氣溶膠粒子在呼吸道不同部位的到達(dá)量 羊舍內(nèi)環(huán)境中每分鐘可到達(dá)人和羊呼吸道深部的真菌粒子數(shù)分別為12.7～16.9 CFU和11.5～13.9 CFU，由高到低依次為晉南、晉中和晉北。見表1。

2.3 晉北、晉中和晉南地區(qū)羊場(chǎng)氣載真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬 Andersen 6級(jí)采樣器在3個(gè)地區(qū)總計(jì)捕獲活性真菌粒子7 888 CFU，共鑒別出可培養(yǎng)真菌25個(gè)屬(群)。晉北羊場(chǎng)優(yōu)勢(shì)菌屬為Cladosporium(35.0%)，Trichophyton(17.1%)，Penicillium(7.7%)和Aspergillus(7.5%)；晉中優(yōu)勢(shì)菌屬為Penicillium(22.5%)，Aspergillus(21.7%)和Alternaria(9.1%)；晉南的優(yōu)勢(shì)菌屬為Penicillium(36.1%)和Aspergillus(28.3%)。

表1 人和動(dòng)物呼吸道不同部位的氣載真菌到達(dá)量 (CFU/min)

2.4 3個(gè)地區(qū)羊場(chǎng)樣品的ERIC-PCR圖譜分析 ERIC-PCR指紋圖譜中泳帶的數(shù)量和位置反映真菌菌群的多樣性，泳帶的亮暗反映DNA的豐度。外環(huán)境的氣載真菌樣品ERIC-PCR擴(kuò)增條帶數(shù)由北向南增加，舍內(nèi)與外環(huán)境規(guī)律基本一致，詳見圖2。

圖2 各地區(qū)羊場(chǎng)氣載真菌、飼料、糞土ERIC-PCR指紋圖譜

M： DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1～9泳道： 羊舍外環(huán)境；10～18：羊舍內(nèi)環(huán)境；19～27： 糞土；28～36： 飼草。其中1～3、4～6、7～9： 晉北、晉中、晉南各3棟羊舍外環(huán)境的氣載真菌樣品，其他依次類推

聚類分析結(jié)果顯示：不同地區(qū)樣品的ERIC-PCR電泳條帶相似性較低，同地區(qū)飼草、糞土、氣載真菌的菌群組成相似度較高；其中各地區(qū)羊舍內(nèi)氣載真菌均與糞土中真菌菌群相似度最高(相似系數(shù)0.60～0.70)，見圖3。

圖3 各地區(qū)羊場(chǎng)氣載真菌、飼料、糞土聚類分析圖

利用Quantity One分析ERIC-PCR圖譜顯示，各地區(qū)羊舍內(nèi)、外環(huán)境的氣載真菌菌群和糞土中真菌菌群的Shannon-wiener指數(shù)H′均由北向南逐漸增大，Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)C則逐漸減小；飼草中呈現(xiàn)相反規(guī)律。見表2

3 分析與討論

Oliveira M[24]等在2003年研究了葡萄牙波爾多市真菌孢子濃度的季節(jié)分布，發(fā)現(xiàn)總孢子濃度與風(fēng)速呈負(fù)相關(guān)，與溫度和相對(duì)濕度呈正相關(guān)。山西省由北向南其年均溫度、年均降雨逐漸升高，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羊場(chǎng)外環(huán)境氣載真菌濃度由北向南也呈升高趨勢(shì)，與Oliveira M等的研究結(jié)果一致。但3個(gè)地區(qū)的羊舍內(nèi)氣載真菌濃度未出現(xiàn)由北向南梯度變化，主要是因?yàn)槎狙蛏岱忾]，受外界環(huán)境因素較小，舍內(nèi)氣載真菌濃度與圈舍的通風(fēng)情況、衛(wèi)生條件密切相關(guān)。本試驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)羊舍內(nèi)氣載真菌濃度為羊場(chǎng)外環(huán)境的2.1～9.4倍，受地域影響較小，與其他動(dòng)物圈舍相比，羊舍內(nèi)的氣載真菌濃度高于豬舍和牛舍[25-26]，這可能與動(dòng)物的生活習(xí)性、圈舍結(jié)構(gòu)、飼養(yǎng)管理等因素有關(guān)。

表2 不同地區(qū)羊場(chǎng)真菌Shannon-wiener多樣性指數(shù)和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，真菌氣溶膠粒子集中分布在采樣器的Ⅲ～Ⅴ級(jí)(1.1～4.7 μm)，峰值均出現(xiàn)在Ⅳ級(jí)(2.1～3.3 μm)，除與豬舍有所差異外，與雞舍、牛舍、兔舍均一致[1，26]。研究證實(shí)吸入同樣劑量的小粒子氣溶膠比大粒子的危害更大[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，羊舍內(nèi)可進(jìn)入并沉降于人和動(dòng)物呼吸道深部甚至肺泡的真菌粒子由北向南其比例增大，即對(duì)人和動(dòng)物的危害逐漸嚴(yán)重。舍內(nèi)、外真菌氣溶膠粒子CMD值由北向南均逐漸減小，接近甚至小于2.5 μm，而PM2.5細(xì)顆粒物可長(zhǎng)時(shí)間懸浮于空氣中，且能通過肺泡血?dú)饨粨Q進(jìn)入血液循環(huán)后到達(dá)全身各處，從而造成多器官、多系統(tǒng)的損傷[29]。

枝孢霉菌屬(Cladosporiumspp)是養(yǎng)殖場(chǎng)常見的優(yōu)勢(shì)菌屬，可侵染肺部或皮下組織，部分可引起皮膚著色真菌病或系統(tǒng)性暗色絲孢霉病，是真菌過敏癥的重要病原之一[30]。毛癬菌屬(Trichophytonspp)包括須癬毛癬菌、紅色毛癬菌和疣狀毛癬菌等，是引起人或動(dòng)物的皮膚真菌病的主要病原菌，其主要傳染途徑為空氣和接觸傳播，晉北羊舍的枝孢霉屬和毛癬菌屬占比高達(dá)35%、17.1%，提示該地區(qū)羊群真菌性皮膚病感染普遍，應(yīng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，制定相應(yīng)的控制措施[31]。苗增生等人報(bào)道枝孢屬、青霉屬、曲霉屬和鏈格孢是兔舍內(nèi)的優(yōu)勢(shì)真菌菌屬[8]；王雅玲報(bào)道，曲霉屬和青霉屬在山東省部分雞舍環(huán)境中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[32]；在本試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)青霉屬和曲霉屬是3個(gè)地區(qū)羊場(chǎng)的共有優(yōu)勢(shì)菌屬，與兔舍和雞舍的結(jié)果一致。曲霉屬(Aspergillusspp)常見的包括黃曲霉、黑曲霉、赭曲霉、煙曲霉等，可產(chǎn)生真菌毒素，引起動(dòng)物的急慢性中毒，并造成免疫抑制，生長(zhǎng)障礙，或誘發(fā)癌變，而曲霉菌屬主要存在于發(fā)霉的飼草中，提示養(yǎng)殖場(chǎng)的干草應(yīng)存放在通風(fēng)、干燥的環(huán)境中，青貯飼料嚴(yán)格按照制作規(guī)程進(jìn)行，防止腐爛霉變。

ERIC-PCR結(jié)果顯示，3個(gè)地區(qū)的舍飼羊場(chǎng)真菌菌群相似性較低，具有明顯的多態(tài)性，但同圈舍的氣載真菌菌群組成與飼草、糞土間相似度較高，可見飼草、糞土是養(yǎng)殖環(huán)境中真菌氣溶膠的主要來源。Shannon-Wiener指數(shù)常與Simpson指數(shù)共同使用來反映生物群落的多樣性，羊舍內(nèi)、外氣載真菌和糞土菌群的Shannon-Wiener指數(shù)均由北向南逐漸增大、Simpson指數(shù)則逐漸減小，反映出山西省由北向南羊場(chǎng)氣載真菌菌群真菌種屬豐富度增高，優(yōu)勢(shì)度逐漸減小。飼草中真菌菌群由北向南豐富度降低，優(yōu)勢(shì)度增加，與空氣中呈相反規(guī)律，其原因可能為晉北的牧草種類較多且來源不一，其聚集的微生物種類也相對(duì)多樣[33]，而晉南的飼草品種和來源相對(duì)單一，優(yōu)勢(shì)微生物相對(duì)穩(wěn)定。不同地區(qū)羊舍的氣載真菌菌群差異較大，但均與該羊舍內(nèi)糞土菌群相似度最高，提示糞土是真菌氣溶膠的主要播散源。