皮諾斂酸純化方法及其生理功能研究進展

董欣睿,包怡紅

(東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

皮諾斂酸(Pinolenic acid,PLA)是裸子植物松科種子特有的Δ5型多不飽和脂肪酸的一種,結構式為順5,9,12-十八碳三烯酸,是必需脂肪酸γ-亞麻酸(GLA)的異構體,雖然PLA不屬于必需脂肪酸,但它與必需脂肪酸的作用相似,參與類花生酸的生物合成[1]。不同松子油中所含皮諾斂酸含量不同,如西伯利亞松子(Pinussibirica)PLA含量約為總脂肪酸的19%,紅松松子(P.koraiensis)PLA含量約為總脂肪酸的14%[2]。目前PLA的純化方法主要有尿素包合法[3]、溶劑分餾法[4]、酶法[5]等。皮諾斂酸具有多種生理功能,如減肥[6]、降脂[7-9]、增強胰島素敏感性[10]、抗炎特性[11]、抑制腫瘤轉移[12]等。由于其多種生理功能,研究者嘗試采用不同方法對其進行純化,以提高其產量。對皮諾斂酸的純化常采用物理方法或酶促反應法[1],但目前國內缺少對皮諾斂酸純化方法的綜述,因此本文主要總結了皮諾斂酸的多種純化方法,并對其生理功能進行總結,以期為后續關于皮諾斂酸的研究提供參考。

1 皮諾斂酸的純化方法及檢測

提取皮諾斂酸的方法有:物理方法[3,13]、酶促反應法[14-15]、物理法與酶促反應法相結合[5]。目前所報道的物理方法主要包括尿素包合法和溶劑分流法。酶促反應法常采用具有不同專一性的脂肪酶,利用酶的特異性、選擇性和高效性,達到純化皮諾斂酸的目的。為得到更高純度的皮諾斂酸,有學者嘗試將物理法與酶促反應法相結合。

1.1 物理方法

1.1.1 尿素包合法 尿素包合法是一種分離脂肪酸的經典方法。在某些條件下,尿素分子與長鏈飽和脂肪酸可形成螺旋形結構絡合物。尿素分子和長鏈烷烴之間存在強大的范德華吸引力,長鏈烷烴被保留在尿素絡合物的圓形通道中。大多數尿素包合物是六面體結晶,而純尿素分子為四面體結晶。具有長鏈和飽和烴鏈的烷酸才能形成尿素包合物,而支鏈和環狀分子或鏈長小于6～8個碳原子的物質很少形成尿素包合物。同樣,較短鏈長的脂肪酸或包含諸如雙鍵以及環氧基或羥基官能團的脂肪酸不可能形成包合物。根據溶劑的選擇和尿素與脂肪酸的比例,可以控制尿素包合物中脂肪酸的含量。甲醇或乙醇常被用作溶劑,尿素與脂肪酸的比例越高,就會有更多的脂肪酸與尿素形成復合物[1]。尿素包合法是制備皮諾斂酸最常用的物理方法。Lee等[3]研究顯示了不同溶劑中不同尿素與脂肪酸之比對皮諾斂酸純化結果的影響。結果表明,在乙醇中尿素與脂肪酸的比例分別為1∶1、2∶1和3∶1時,PLA的含量從14.1%增加到16.8%、23.0%和45.1%。在甲醇中,尿素與脂肪酸的比例分別為1∶1、2∶1和3∶1時,PLA的含量從14.1%增至15.1%、20.4%和33.6%。通過在乙醇中尿素與脂肪酸以3∶1的比例進行結晶,可以得到最高的PLA濃度(3.2倍的升高)。楊明非等[16]采用尿素包合法富集混合脂肪酸中皮諾斂酸,皮諾斂酸甲酯質量分數最高達到45.8%。劉志鑫等[17]根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理,建立皮諾斂酸的尿素包合回歸模型,經過多次包合試驗,將皮諾斂酸含量由一次包合的39.27%提高到了53.36%。張晶等[18]采用尿素包合法純化皮諾斂酸,通過優化脂肪酸與尿素的比例、尿素與乙醇的比例、包合溫度及包合時間等因素,得到經二次尿素包合純化后純度為72.5%的皮諾斂酸。尿素包合法的優勢在于其應用設備簡單、工藝簡便、成本低廉,但難以將雙鍵數接近的脂肪酸分開[19-20]。

1.1.2 溶劑分餾法 分餾(也稱為分步結晶)是一種物理過程,它根據可控脂質在受控溫度下具有不同不飽和度的脂質成分的溶解度,將可食用脂質(例如TAG或FA)分離為固體餾分和液體餾分[21]。工業規模分餾過程的兩種主要類型是干法分餾和溶劑分餾,與干法分餾相比,溶劑分餾的主要優點是分離效率高,目標餾分具有高回收率。由于溶劑分餾法需要大量的設備投資及較高的運營成本,因此其通常用于生產高附加值的脂質產品[22]。使用有機溶劑(例如正己烷或丙酮)進行溶劑分餾可以使更多的具有高熔點的飽和脂質成分結晶,而更多的具有低熔點的不飽和成分仍溶解在溶劑中。溶劑分餾已成功應用于多種有益健康的脂肪酸分離,例如長鏈n-3多不飽和脂肪酸(例如二十碳五烯酸(C20∶5n-3)和二十二碳六烯酸(C22∶6n-3)[23]和γ-亞麻酸(C18∶3n-6))[24]。

由于PLA的濃縮物適用于功能性食品和營養保健品,具有很大的應用價值,因此采用溶劑分餾法將松子油中獲得的游離脂肪酸(FFA)用于制備PLA濃縮物。Chung等[4]將含有18.3%PLA的西伯利亞松子油用作分餾的原料。在低至-85 ℃的超低溫下在正己烷中進行分餾,在研究確定的最佳條件下生產的PLA濃縮物(溫度為-85 ℃;正己烷與FFA的比例(V/w)為30∶1;分餾時間為36 h)含有69.8%的PLA。在FFA中,PLA的產率為初始PLA重量的77.4%。這些結果表明,與Woo等[13]采用尿素結晶的方法(例如,PLA含量約為47%,PLA的產率可達到77%)或Lee等[14]使用的脂肪酶催化的反應(例如PLA含量約為30%,PLA產率可達到61%)相比,溶劑分餾是一種制備具有更高PLA含量的皮諾斂酸濃縮物的有效方法。此方法還可用于分離其他物質,如Bootello等[25]用溶劑分餾法制備高熔點硬脂精,Kang等[22]通過雙溶劑分餾從棕櫚硬脂精中選擇性富集對稱單不飽和三酰基甘油。

1.2 酶促反應法

酶促反應法以其專一性、催化高效性、條件溫和性等特點,使其在皮諾斂酸純化方面的應用引起了人們廣泛關注。不同的脂肪酶可以催化不同脂肪酸與醇發生酯化反應。在應用酶促反應法進行皮諾斂酸的純化時,成功與否取決于脂肪酶的特異性與脂肪酸的特性。在松子油中,油酸和亞油酸是脂肪酸的主要成分,如在紅松松子油中,油酸和亞油酸占總油脂的百分比超過70%[26]。因此,從松子油的脂肪酸混合物中消除這兩種脂肪酸可有助于PLA的富集。一方面,油酸和亞油酸都是Δ9型不飽和脂肪酸,來自褶皺假絲酵母(Candidarugosa)的脂肪酶具有針對常規Δ9型不飽和脂肪酸的特異性,是對松子仁油和乙醇進行脂肪酸酯化反應的理想酶。通過酯化反應,在褶皺假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶存在的情況下,油酸和亞油酸主要與乙醇反應并形成脂肪酸乙酯。另一方面,PLA是Δ5型不飽和脂肪酸,反應較不容易進行,且仍以未反應的游離脂肪酸形式存在。因此,它可以存在于未反應的脂肪酸部分[1]。最近No等[5]研究了使用褶皺假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶將松子油中的脂肪酸與月桂醇進行酶促酯化反應。通過該反應,PLA占游離脂肪酸組分從最初的13%富集成高達43%。Zhao等[15]使用循環填充床反應器(RPBR)并結合Novozym 435脂肪酶催化,實現從松子油中濃縮生產皮諾斂酸。當最佳溫度、摩爾比(松子油:乙醇)和在RPBR中通過脂肪酶催化水解生產PLA濃縮物的最佳停留時間分別為45 ℃、1∶50和3 min時,在反應的最初10 min內,獲得了濃縮物中最大的PLA含量(36.1%)。No等[5]采用尿素包合與脂肪酶催化酯化相結合的辦法,實現了皮諾斂酸的高效富集。在尿素與脂肪酸之比大于3∶1 (wt/wt)的情況下,可以獲得純度大于95%的PLA,并且在尿素與脂肪酸的比例為5∶1的情況下,可以生產出100%的純PLA,且收率為8.7%。

1.3 其他純化方法

除了上述提到的方法外,多不飽和脂肪酸的富集純化方法還有超臨界流體萃取法、脂肪酸金屬鹽法、銀離子絡合法等[27]。超臨界流體萃取法常用CO2作為溶劑,黃俊輝等[28]利用超臨界CO2萃取技術提取了海帶中的多不飽和脂肪酸,萃取的PUFA達67.2%。脂肪酸金屬鹽法利用不同脂肪酸的金屬鹽在有機溶劑中溶解度不同來分離,在有機溶劑中飽和脂肪酸金屬鹽的溶解度小于不飽和脂肪酸金屬鹽[29]。鄭公銘等[30]利用脂肪酸金屬鹽法純化EPA、DHA,通過結合尿素包合法純化EPA、DHA含量達82.57%。銀離子絡合法依據多不飽和脂肪酸雙鍵數目不同來分離,雙鍵越多極性絡合物所結合的銀離子越多。劉卓華等[31]利用硝酸銀絡合法,富集了金槍魚魚油中EPA、DHA,濃縮產品中的EPA、DHA總質量分數達95.85%。對上述方法的總結,為皮諾斂酸的純化提供參考,可采用多種方法相結合,以得到高純度的皮諾斂酸。

2 皮諾斂酸的生理功能及應用

2.1 食欲抑制與體重控制

皮諾斂酸可以通過刺激人體分泌兩種饑餓感抑制激素:膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)、胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide-1,GLP-1),來達到抑制食欲的作用。負責CCK和GLP-1釋放的TAG(TAG是形成皮諾斂酸的前體)的吸收與代謝是誘導飽腹感的必要條件。有研究表明PLA對腸道激素釋放的影響很可能是通過乳糜微粒的形成來介導的[1]。鏈長超過12個碳原子的脂肪酸作為乳糜微粒被吸收到循環系統中,CCK信號通路與乳糜微粒的運輸密切相關。因此,PLA影響乳糜微粒的形成或運輸,從而影響CCK的釋放。這種釋放導致胃排空的延遲,進而導致飽腹感增加和食欲降低。另一方面,從遠端小腸釋放的PLA誘導的GLP-1在通過維持兩餐間飽腹感來抑制餐后攝入方面可能對食欲的抑制作用更重要[32]。CCK與GLP-1不僅能幫助機體更好的消化脂肪,還能向大腦傳遞“飽腹感”信號,降低食欲,故有助于控制熱量的攝取[32-34],達到減肥的效果。

2.2 血脂調節

PLA具有降脂作用,因此降低了患因血脂異常所導致的疾病風險。雖然其機制尚未完全揭示,但有研究者提出了一些假設。其中之一是PLA通過改變各種載脂蛋白基因的表達來發揮其降脂作用。載脂蛋白在脂質代謝中起關鍵作用:ApoA-Ⅰ和apoA-Ⅱ是HDL代謝的關鍵蛋白;ApoE對于清除脂蛋白殘留是必需的;ApoC-Ⅲ是富含三酰甘油的脂質顆粒的主要成分,會干擾極低密度脂蛋白(VLDL)脂解和其細胞受體的攝入。皮諾斂酸可通過增加肝臟LDL吸收來降低血清中LDL的水平。另一種機制是PLA有助于降低三酰甘油水平的一些性質,原因有:減少從頭脂質的合成;脂蛋白形成的底物利用率降低;VLDL物理化學性質發生變化。因此,補充PLA可能會降低三酰甘油和VLDL水平,表明其具有降低血液中高三酰甘油水平的作用[35]。Zhang等[9]證明了皮諾斂酸對油酸(OA)誘導的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用及其與脂質代謝調節的關系。結果表明,用PLA處理可顯著抑制HepG2細胞中脂質積累,氧化應激以及油酸誘導的炎癥反應。PLA還顯著降低了細胞三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的水平。PLA具有通過上調AMPK/SIRT1信號通路來防止OA誘導的HepG2細胞中脂質積累的作用。Lee等[8]將HepG2細胞在補充有50 μmol/L BSA(對照),棕櫚酸、油酸、γ-亞麻酸、皮諾斂酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸(EPA)的無血清培養基中孵育24 h,證明了PLA通過減少與脂質合成,脂蛋白輸入和脂肪生成途徑調節有關的一些基因表達水平來下調肝細胞中的脂質合成代謝途徑。Park等[36]研究表明攝入含有皮諾斂酸的松子油會導致高脂飲食(HFD)引起的肥胖癥患者體內脂肪減少和降低肝組織的TAG水平。

2.3 胰島素敏感性增強

胰島素(insulin)為機體重要降糖激素,可促進葡萄糖氧化利用、促進脂肪蛋白質及肝糖原肌糖原合成,并抑制胰高血糖素分泌及肝糖原與脂肪分解,在血糖平衡與代謝穩態調控中發揮關鍵作用[37]。脂肪酸在許多組織中(如包括胰島素反應性在內的組織),起到激活游離脂肪酸受體家族(FFA1、FFA2、FFA3和FFA4)的作用[38]。有研究表明,PLA作為FFA1和FFA4的配體具有很大的效力[10,39]。FFA1的激活導致胰島β細胞對受葡萄糖刺激所產生胰島素的分泌量增加[38,40],而FFA4的激活會增強機體對胰島素的敏感性[41-42]。Christiansen等[10]證明,在給予PLA或PNO的小鼠中,葡萄糖暴露30 min后可觀察到降血糖作用。由此得出PLA對FFA1和FFA4的共激活可以增強葡萄糖依賴性胰島素的分泌并促進血糖降低。

2.4 抗炎作用

脂肪酸可以通過從細胞膜到細胞核的多種機制抵抗炎癥反應。脂肪酸可以在細胞表面和細胞內受體起作用來控制炎癥細胞信號傳導和基因表達模式。炎性細胞膜脂肪酸組成的修飾可以改變膜的流動性、脂質筏的形成和細胞信號傳導,從而改變基因表達,并且可以改變脂質和肽介體的產生。炎癥細胞暴露于不同類型的脂肪酸中會影響其功能,因此脂肪酸具有改變炎癥過程的潛力[43]。通過飲食攝入不同種類脂肪酸達到影響炎癥介質(包括脂質和肽)的產生[44]。

有研究表明,在脂多糖(LPS)(一種刺激產生炎癥的物質)刺激的鼠小膠質BV-2細胞中,PLA降低了一系列促炎介質的產生。用濃度為50 μmol/L的PLA培養細胞可使一氧化氮(NO)、白介素(IL)-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產生分別減少41%、74%和27%。還觀察到前列腺素E2(PGE2)的水平顯著下降。當使用大鼠原發性腹膜巨噬細胞時,也觀察到了類似的現象,用LPS刺激后,PLA降低了NO和PGE2(減少了35%)的產生[45]。同樣,PLA降低了LPS刺激的鼠巨噬細胞RAW264.7的PGE2產生,PLA可改變細胞磷脂的脂肪酸譜,提高二十碳脂肪酸向二十二碳脂肪酸的延伸率[46],促進細胞膜脂肪酸結構組成的改變。

2.5 抑制癌癥轉移

癌癥轉移是由于癌細胞侵入周遭局部正常組織或通過體內循環系統、淋巴系統轉移到身體其他部位。飲食中一些多不飽和脂肪酸可影響癌癥轉移。有研究表明,飲食中的脂肪與乳腺癌的發病率密切相關,并且某些飲食中的必需脂肪酸會影響乳腺癌的致癌作用[47-48]。

Chen等[49]研究了PLA對人乳腺癌細胞的作用。通過補充PLA,乳腺癌細胞的運動性和侵襲性降低了25%,但是未觀察到對細胞增殖或細胞基質粘附的影響。用PLA孵育細胞會改變細胞的多不飽和脂肪酸(PUFA)組成,而對照組的細胞,花生四烯酸(AA)的百分比從12.6%降低至4.9%。由于AA水平降低,PGE2合成也受到影響(AA是PGE2的前體),因此證明了與PLA相關的PGE2產量呈劑量依賴性降低。由于PA顯著降低了細胞PGE2的產生,因此該脂肪酸還可以調節乳腺癌細胞的增殖和轉移。與PLA孵育后,這些細胞中COX-2的表達量也有所降低。這些研究表明,PLA可以降低細胞運動性和侵襲性。

3 展望

由于皮諾斂酸具有降脂、減肥、抗炎、抑制癌癥轉移等功能,廣泛引起人們的關注,但皮諾斂酸僅存在于松子油中,限制了皮諾斂酸相關保健品的開發。對松子油中皮諾斂酸純化方法的探索,可提高皮諾斂酸的產量,促進其工業應用。

多不飽和脂肪酸可通過微生物異源表達而提高產量,如EPA、DHA合成基因在裂殖壺菌中的異源表達。因此,研究皮諾斂酸的代謝途徑,開發其相關基因在微生物中的異源表達,擴大其來源途徑,將成為未來研究領域的一個重要方面。本文對皮諾斂酸的純化方法及其生理功能進行綜述,以期為皮諾斂酸開發為食品、保健品的功能性配料提供參考。