代謝組學在植物多酚類物質檢測分析中的應用

于淼，王長遠,2，王霞*

1(黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶，163319) 2(國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶，163319)

代謝組學(metabolomics)這一概念在20世紀70年代被DEVAUX第一次提出[1]，隨后在1999年英國倫敦大學NICHOLSON教授將其重新定義[2]。代謝組學又稱代謝物組學，是繼基因組學、蛋白質組學、轉錄組學后出現的新興“組學”。它能夠對生物體內相對分子質量1 000以內的代謝物進行定性和定量的分析。代謝組學最主要的技術手段包括質譜、氣相色譜、液相色譜、液相色譜-質譜聯用(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)、氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrograph，GC-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)，而目前使用的分析手段多為組合式聯用型儀器，如超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS)、超高效液相色譜-串聯質譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)等。依靠其高通量、高靈敏度、檢測范圍廣的特點,可以對因各種外界因素刺激而引起的植物表型變化、生理活動變化以及代謝變化進行檢測分析，通過代謝物的變化探討引起植物出現差異的原因[3]。完整的代謝組學研究過程，包括樣品采集、代謝物提取、代謝物分離、代謝物檢測和數據分析，要求盡可能地保留代謝物信息。代謝組學的研究方法主要分為非靶向代謝組學分析和靶向代謝組學分析[4]。二者研究目的不同，各有特點。在實際運用中，通常在前者發現差異代謝物之后，再利用后者進行進一步的確證，常常結合使用，優勢互補。

植物多酚是植物中一類化學物的總稱，其作為人體“第七類營養素”廣泛存在于植物性食物中，人體不能通過自身合成，需從食物中獲取[5]。多酚類化合物作為植物代謝過程中的次生代謝物，已經被分離鑒定出八千多種，是自然界最常見的一大類植物活性物質[6]。因其種類繁多，結構不盡相同，通常可將多酚分為類黃酮類(flavonoids)、酚酸類(phenolic acids)、芪類(stilbenes)以及木脂素類(lignans)，這些結構上的差異導致其生物利用率、功能活性也均存在差異。研究表明，多酚類物質作用于人體的生理功能主要包括抗氧化[7]、抗炎[8]、抗癌[9]、降血脂[10]、降血糖[11]等。隨著人們對天然產物的開發利用，對多酚類物質的研究也將更為深入，挖掘其更多的功能活性作用。

因植物中的多酚類物質易受品種、種植條件、儲藏條件、加工過程等方面的影響，從而導致其功能活性也發生變化，所以依靠代謝組學技術對植物中多酚類物質的檢測分析能夠幫助人們建立代謝物與功能活性變化的聯系。本文主要論述了代謝組學作為一種工具在植物多酚定性定量，植物食品質量、種類篩選、加工貯藏及其功能活性方面的應用研究。

1 代謝組學技術在多酚定性定量檢測中的應用

代謝組學技術在植物多酚定性定量分析方面占據主導地位，目前主要應用在果蔬、雜糧、茶葉、油脂等植物源性食品方面[12-17]，通過高通量的檢測和開放式數據庫，可以對植物中多酚類物質進行定性和定量，還可以發現新型多酚類物質，有助于對植物多酚領域的深入研究。謝佳函等[18]利用HPLC技術將經過超聲輔助提取的紅豆皮多酚進行定性分析，通過與各標準品的色譜峰保留時間相比對，最終定性了金絲桃苷、沒食子酸、蘆丁等13種單體酚，其中主成分峰對應的物質是金絲桃苷。胡會剛等[19]采用液相色譜-四級桿-飛行時間質譜(liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，LC-Q-TOF-MS)對經過分離純化的芒果皮渣多酚組分進行初步定性分析，共檢測出與已知數據庫相對應的17個色譜峰，其中正離子模式下為槐角苷等3種多酚化合物，負離子模式下為6-O-沒食子酰葡萄糖等14種多酚化合物。鄒夢瑜等[20]進行了葡萄酒中多酚類化合物的體內外成分分析，使用了高效液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質譜(high performance liquid chromatography-fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，HPLC-FT-ICR MS)和超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)鑒定了葡萄酒多酚提取物中的41種酚類化合物和灌胃入血后的9種多酚原型及代謝物，并利用UPLC快速、靈敏的特點，對這9種潛在活性物質基礎成分進行了含量測定，但具體探究其功能活性的機制還有待研究。張云[21]和焦陽[22]分別研究了獼猴桃果實及其種植中的副產物獼猴桃疏果，分別運用高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography, HSCCC)與制備型高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)聯用技術和超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(UPLC-QQQ-MS/MS)。前者通過篩選建立的HSCCC溶劑體系對純化后獼猴桃多酚提取物具有較好的分離效果，基于此分離出一種非常罕見的酚酸類結構：2-O-咖啡酰基蘇糖酸；后者成功實現了在22 min運行時間內對15種酚類化合物進行有效的分離和精確定量，從而確定表兒茶酸是獼猴桃疏果中含量最高的多酚化合物，此類方法顯著縮短了測量時間，高效且靈敏。潘匯[23]將荷葉在2種溶劑系統中分離純化的3種多酚進行HPLC檢測分析，結果表明這3種多酚物質分別為紫云英苷、異槲皮苷和槲皮素。

代謝組學技術在植物多酚定性定量分析中的應用逐漸增多，相比于氣相色譜和液相色譜靈敏度更高，對于多酚物質的定性更準確。通過組學平臺雖然可以對多酚類物質進行檢測，但多樣化的檢測儀器所得到的檢測結果也是不同的，而且對于植物樣本的前處理也沒有規范的方法，所以目前急需建立系統性的多酚高通量檢測平臺，規范植物樣本前處理的方法，形成完整檢測分析體系。

2 代謝組學技術定性定量多酚的應用

2.1 定性定量多酚在不同加工方式研究中的應用

日常生活中植物性食品通常會經過不同方式的處理被加工成食物，以提升其食用品質。多酚類物質不穩定，如加熱可導致其結構受到破壞，降低其功能性質。而在發酵中多酚可促進有益菌的生長，抑制有害菌的繁殖等，此過程中多酚的含量會發生變化或被轉化成其他類物質等。植物食品在不同加工過程中多酚物質的含量和結構均會發生改變，進而影響其功能作用。通過代謝組學手段可以對多酚物質進行檢測，從而分析不同處理方式下多酚的變化情況。ZHAO等[24]將光電二極管陣列檢測器(photo-diode array, PDA)和質譜儀與超高效液相色譜結合使用，研究了烘烤，煮沸和微波處理方法對藍莓中多酚的影響。在藍莓中發現了28個特征峰，其中25個峰受烹飪的影響很大，咖啡酰奎尼酸、兒茶素和槲皮素糖苷在加工中最穩定，該研究比較得出微波烹飪對多酚類物質的影響最大。LONG等[25]為研究堆發酵過程中茶葉活性物質的變化，采用液相色譜-串聯質譜聯用技術(LC-MS)，通過非靶向代謝組學分析表明，堆發酵的第一階段使黃酮-3-醇和沒食子酸的含量降低。靶向代謝組學分析表明，在堆發酵第一階段之后，葛根素(N-乙基-2-吡咯烷酮取代的沒食子兒茶素和兒茶素)的含量顯著增加，但是長期的堆發酵會使黃酮糖苷，原花青素和沒食子酸的水平明顯降低。姜麗等[26]的研究采用氣相-飛行時間質譜聯用(GC-TOF-MS)對傳統曲和新基質曲釀造的黑糯米酒進行差異代謝物的分析，并對發酵72 h內的黑糯米酒進行了跟蹤研究，發現苯酚為2種曲釀酒后差異最大的物質，并在發酵60 h時，代謝物積累量最大且差異代謝物數目最多。ERICA等[27]利用核磁共振對酵母菌發酵的蘋果酒的生產過程進行實時監測，代謝譜的研究中發現酵母菌種類不同對表兒茶素、兒茶素等酚類物質的種類及含量均有影響，為蘋果酒生產中涉及的酵母種類之間的代謝差異提供了初步見解。張靈敏等[28]利用HPLC建立了快速有效的多酚定量分析方法，確定了3個釀酒葡萄品種中的16種單體酚含量，從多酚成分含量角度對釀酒葡萄進行評價提供了依據。PINTO等[29]將頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜(HS-SPME-GC/MS)相結合和質子核磁共振(1H NMR)光譜研究了霞多麗葡萄在橡木桶中儲存時間對多酚類物質變化的影響，發現了多酚變化與葡萄酒褐變的關系。

2.2 定性定量多酚在品種、產地區分中的應用

每種植物都有不同的品種，而且種植范圍廣，不同的品種和產地導致植物中多酚類物質產生差異。如市售的不同品種的蘋果，顏色外觀，口味營養各不相同，這些差異與多酚的種類與含量密不可分。通過代謝組學手段可以對多酚物質進行檢測，從而分析不同品種、產地的植物產品中多酚的差異情況。FRANCINI等[30]利用1H NMR技術結合主成分分析(principal component analysis, PCA)，對不同品種的蘋果干中的多酚類物質進行研究分析，發現了蘋果干中兒茶素、表兒茶素、綠原酸等活性物質及其抗氧化能力是區別其品種的判斷依據。ALESSIO等[31]為區別不同產地的特級初榨橄欖油，對多個樣品進行了分析目標氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)和綜合二維氣相色譜-質譜(GC/GC-TOF-MS)的非目標譜分析，發現各產地的橄欖油之間在多酚的特征方面的差異是顯著的。對不同產地植物性食品中的多酚類物質進行代謝組學分析有助于建立成熟的食品溯源體系[32-33]。KASHIF等[34]使用PCA和偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)等相關多元數據分析與1H NMR相聯系對3個品種的葡萄的4個發育階段進行多變量數據分析以識別總體代謝差異，發現“Trincadeira”較其他2個品種酚類含量低，并且此類葡萄發育初始階段顯示出較高的酚類含量，這在生理學上增加了人們對葡萄生長發育的理解。

2.3 定性定量多酚在品質、等級區分中的應用

多酚類物質的種類和含量對植物性食品的風味和品質具有重要影響，也逐漸成為評價和衡量植物食品等級的重要指標之一。通過代謝組學手段可以對多酚物質進行檢測，從而分析不同品質、等級下多酚的變化情況。在茶葉中，人們通常會忽略除兒茶素和黃酮醇以外的多酚對茶澀性的影響。ZHUANG等[35]使用液相色譜-質譜法,通過靶向代謝譜分析評估了多酚的貢獻，從47種綠茶樣品中鑒定出86種多酚，其澀味評分各不相同，結果表明，多酚的單羥基黃酮醇和酰基衍生物與除沒食子酸和兒茶素以外的多酚呈負相關，與其他多酚呈現明顯的分離，反映出此類物質多茶澀味的獨特作用。郭雪梅[36]采用HPLC對8個不同等級的祁門紅茶進行多酚定量分析，發現高等級紅茶中,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)明顯高于低等級，同時通過高分辨質譜(LC-LTQ-Orbitrap)對不同等級紅茶樣品進行非靶標代謝組學分析，在多元統計分析方法下從不同等級的紅茶中共篩選出17個差異代謝物，通過相關性分析最終確定3個代謝物作為判斷紅茶等級的標準物。

通過代謝組學的方法可對加工后的植物食品中的多酚物質進行檢測，探討不同處理對多酚含量和結構的影響。品種和產地的不同，導致植物中多酚含量存在差異，反之通過對多酚物質的檢測分析，可將不同品種和不同產地的植物產品進行區分。對于品質的差異也可以用多酚的含量與種類進行區分。但目前這些研究僅停留在代謝物含量的分析上，對于出現差異的機理研究并不多，關于代謝通路的分析也較少，代謝途徑的分析將更全面的解釋這些現象。

2.4 定性定量多酚在多酚功能活性研究中的應用

植物多酚具有較好的功能活性，對于疾病的預防和治療有很好的功效，目前多酚的功能活性主要體現在抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂方面。通過動物實驗對多酚功能活性的研究較多，體內實驗的研究將多酚在臨床治療、保健藥品、食品的推廣趨向于安全化、可應用化,也提升了多酚的應用價值。SEVERINA等[37]對來自意大利坎帕尼亞地區的鼠尾草葉應用液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS)進行定性和定量分析，并首次發現木質素寡聚物，此類物質對抑制AChE酶能力較強，為評估“坎帕尼亞”鼠尾草在動物模型中預防中樞神經系統疾病提供了可能性。與此類似的還有漿果多酚對人體代謝的貢獻[38]。蘇天霞等[39]通過高效液相色譜法,在獼猴桃皮多酚中發現了原兒茶酸、表兒茶素、七葉亭等多酚類物質，并對脂代謝紊亂的小鼠進行代謝分析，發現此類多酚物質具有正向調控的作用。CHANG等[40]通過代謝組學研究發現黑豆種皮中的花青素可以降低PGE2、NO以及抑制大鼠中COX-2和iNOS基因的表達而發揮抗炎癥活性。MA等[41]利用LC-MS/MS技術分析了假木霉和黑根霉混合培養發酵液對獼猴桃根際土壤處理后,對其貨架期和果實品質的影響。代謝組學數據顯示，在采摘后室溫(25℃)儲藏條件下,0、10、15 d不同程度地提高了總酚含量，混合培養發酵液處理改變了幾種類黃酮代謝物，對延長保質期和改善水果質量有幫助。湯小芳[42]利用超高液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)代謝組學分析手段，對EGCG干預下的衰老小鼠的血清、尿液、腸道、腦組織進行代謝組學研究，通過差異代謝物的篩選及代謝通路的分析，最終發現了與EGCG抗衰老作用有關的代謝通路及相應代謝物。

目前研究已經證實了植物多酚的許多功能活性，通過代謝組學的方法可以對不同功能活性的多酚進行檢測分析，探究關鍵代謝物及其作用機理，證實多酚單體具有的功能活性，但仍然需要利用尖端的儀器設備進行解析，并逐漸完善分析體系。另外，由于植物多酚中的結合態酚的提取和鑒定操作繁瑣，在研究多酚功能活性中，代謝組學技術主要集中在對游離酚的檢測分析上。未來應進一步研究不同多酚單體的功能評價，以更好地提升多酚的應用價值。

3 多組學技術在多酚功能活性研究中的應用

在對多酚功能活性的研究中，一些植物多酚如白藜蘆醇、EGCG、迷迭香多酚、姜黃素等所表達的抗腫瘤活性逐漸引起人們的注意[43]。代謝組學技術可以發現多酚類物質的更多功能活性成分，但對多酚類物質的抗腫瘤活性的研究則需要其他組學技術和細胞實驗技術的支撐，所以應用多組學技術對多酚類物質功能活性的研究正在逐漸展開。蛋白質組學技術可以從腫瘤信號傳導途徑、腫瘤細胞凋亡等多方面闡明這些活性的產生與癌細胞體內蛋白的差異表達之間的關系，在多酚的功能活性研究中同樣發揮著重要的作用。ZHANG等[44]的研究為確定EGCG對人體肝細胞癌的作用及其分子機制，通過二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜法(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析得知，EGCG有誘導細胞凋亡，抑制人體肝癌細胞轉移的能力，其抗轉移作用與抑制基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性有關。MENORET等[45]經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)、LC-MS/MS分析發現白藜蘆醇具有調節結腸癌細胞HCT116的細胞周期的作用，肌動蛋白、Hsp60等均受到白藜蘆醇的影響。也有研究者將代謝組學與轉錄組學結合使用，利用GC-MS及逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測分析手段研究了迷迭香多酚提取物和鼠尾草酸對HT-29結腸癌細胞轉錄組和膽固醇代謝的影響。研究表明在迷迭香多酚和鼠尾草酸處理下，HT-29細胞激活了調節因子的轉錄活性，在脂質代謝中起關鍵作用。迷迭香多酚處理可誘導HT-29細胞中以活性氧產生和內質網應激下UPR信號通路協調為主導的相關代謝和轉錄變化[46]。

單一的組學技術因其本身技術的局限，只能從特定的角度分析植物多酚的作用機理，目前多組學聯用在植物多酚研究中仍鮮有報道，且均為多酚類物質抗腫瘤活性的研究。對于多酚類物質更多功能活性的研究必須進行體外細胞實驗和小鼠等模型的體內實驗，代謝組學僅是眾多研究平臺中的一部分，多組學平臺聯用將會對植物多酚功能活性的具體、清晰、完整的作用機制研究提供更多可能。

4 總結與展望

隨著組學技術的不斷發展和完善，代謝組學技術將在植物多酚檢測分析中發揮越來越重要的作用，此類技術在幫助人們了解植物中化學成分，并在動態中把握成分變化及其帶來的影響等方面具有重要指導意義。在研究植物性食品的不同品種產地、加工貯藏方式下，可以找出關鍵的代謝物質及代謝途徑中的關鍵節點，可以從更深的角度去闡明代謝物的變化，以及此變化對功能活性、感官品質、機體健康所帶來的影響。目前對于植物多酚類物質的功能活性研究大多是在宏觀意義上的，鮮有對具體多酚物質的研究。利用代謝組學技術可以在探究植物的功能活性上準確找出關鍵的多酚類物質。目前代謝組學仍屬于一種具備潛力、尚待開發的新興學科領域，同時也有很多因素制約了代謝組學在食品科學方面的應用。同時，因其發展時間較短，存在著樣品分析結果不穩定、儀器分析范圍有局限等問題，又因數據庫不完善等原因，導致僅有一部分的代謝產物能夠被識別，未識別的代謝產物仍占比巨大。如何將各種實驗技術和多組學平臺結合起來，對多酚類物質的功能活性進行深入研究，以上述存在的問題。