異甘草素聚乳酸納米粒的制備及在大鼠體內藥動學*

高青，馬記平

(鄭州澍青醫學高等專科學校基礎醫學部，鄭州 450064)

異甘草素(isoliquiritigenin)是從中藥材甘草中提取、分離得到的一種異黃酮類化合物，在肉豆蔻、板藍根、紅血藤等植物中也廣泛存在。具有抗腫瘤、抗氧化、抗心律失常、抗炎、解痙等多種藥理活性[1-2]。但異甘草素水溶性較差，影響了在醫藥領域的應用。 因此非常有必要采用制劑新技術對其進行研究，開發出活性更強、毒副作用更小的異甘草素新型制劑。目前已有脂質體、微乳等制劑的研究[3-5]。

納米給藥系統是指采用高分子材料作為載體，通過一定的制劑技術而制備成粒徑在10～1000 nm之間的微粒[6]。可增加藥物的溶解度及穩定性，促進體內藥物吸收，實現被動靶向等。聚乳酸(polylactic acid，PLA)作為可生物降解的一種高分子材料，體內最終代謝為水和二氧化碳，被譽為“綠色材料”，已被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于醫用材料和各種藥物制劑的制備。王學清等[7]以上市產品新山地明(Neoral?)為參比制劑，對環孢素聚乳酸納米粒在大鼠體內生物利用度進行了研究，結果發現兩者生物利用度相似，但環孢素聚乳酸納米粒采用了生物降解材料，與Neoral?比較避免了表面活性劑Gremophor RH40帶來的毒性與變態反應。另外，根據不同藥物不同的理化性質和藥理作用，可通過調整聚乳酸相對分子質量的大小進而達到控制納米粒釋藥速率的目的。邢潔等[8]采用分子質量相對較小的聚乳酸制備的冬凌草甲素聚乳酸納米粒，體外釋放速率明顯加快，有助于快速達到較高的血藥濃度，迅速發揮鎮痛藥效。戴東波等[9]采用分子質量相對較高的聚乳酸制備的鹽酸阿霉素聚乳酸納米粒，體外緩釋特征非常明顯，48 h內累積釋放度為55.8%，體內藥動學研究結果顯示納米粒在體內消除顯著減緩，體內循環時間顯著延長。本研究以聚乳酸為納米載體，制備異甘草素聚乳酸納米粒(isoliquiritigenin-loaded polylactic acid nanopartic-les)，對粒徑分布、Zeta電位、體外釋藥等進行研究。與異甘草素混懸液對比，研究異甘草素聚乳酸納米粒體內藥動學行為。為異甘草素研究、開發提供新的研究策略，也為其他難溶性中藥活性成分提供參考[10]。

1 儀器、試藥與動物

1.1實驗儀器 高效液相色譜儀(安捷倫儀器公司，型號：Agilent 1260，二極管陣列檢測器)；電子天平(賽多利斯精密儀器北京有限公司，型號：SQP，感量：0.1 mg)；渦旋混合器(其林貝爾儀器制造有限公司，型號：VORTEX-5)；超聲儀(寧波新知科儀器研究所，型號：JY92-II)；粒度分析儀(馬爾文科學儀器有限公司，型號：Master sizer 2000)；氮氣吹掃儀(杭州市奧威儀器有限公司，型號：MD202-3)；高速臺式冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司，型號：GTR22-1)。

1.2試藥 異甘草素對照品(天津一方科技有限公司，批號：20160824，含量：98.8%)；聚乳酸(山東岱罡科技有限公司，批號：2017021522，相對分子質量3000)；poloxamer 188(F68，德國巴斯夫有限公司，批號：T20151205)；甲醇(色譜級)，其他試劑均為分析純。

1.3實驗動物 清潔級SD大鼠，雌雄兼用，體質量(300±20)g，購自河南省動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(豫)2016-0001。所有大鼠飼養在清潔級實驗環境，溫度20～24 ℃，濕度40%～55%。

2 方法與結果

2.1異甘草素含量測定色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.5%甲酸溶液(44：56)；波長：372 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2異甘草素聚乳酸納米粒包封率和載藥量 取異甘草素聚乳酸納米粒混懸液1.0 mL，18 000 r·min-1(r=15 cm)離心60 min后，小心吸取上清液液測定游離的異甘草素含量(W游離)。另取異甘草素聚乳酸納米粒混懸液1.0 mL，加入甲醇超聲破乳后，測定異甘草素總含量(W總)。計算異甘草素聚乳酸納米粒包封率和載藥量。

包封率(%)=(W總-W游離)/W總×100%；載藥量(%)=(W總-W游離)/W總質量×100%。

其中W總為聚乳酸納米粒中異甘草素總量；W游離為聚乳酸納米粒混懸液游離異甘草素量；W總質量為聚乳酸納米粒的總質量。

2.3異甘草素聚乳酸納米粒制備工藝優化

2.3.1異甘草素聚乳酸納米粒的制備工藝 精密稱取異甘草素40 mg和適量聚乳酸溶于30 mL丙酮溶液中(經重蒸處理)，攪拌、溶解后緩慢加入到一定體積、適量濃度的poloxamer 188乙醇-水相中。滴加完畢后，于冰浴中超聲15 min。減壓旋轉蒸發除有機溶劑，濃縮。微孔濾膜濾過，即得異甘草素聚乳酸納米粒。

2.3.2正交實驗優化制備工藝 結合前期異甘草素聚乳酸納米粒單因素實驗考察情況，以包封率為考察指標，選擇處方中聚乳酸載體用量(A，mg)，表面活性劑poloxamer 188濃度(B，%)，乙醇-水體積(C，mL)，乙醇-水比例(D)4個因素為主要影響因素，每個因素設置3個考察水平，采用L9(34) 正交實驗進一步優化異甘草素聚乳酸納米粒的處方，因素水平和實驗設計見表1。

表1 正交實驗設計與結果

Tab.1Designandresultsoforthogonaltest

實驗序號聚乳酸載體用量(A)/mgpoloxamer 188濃度(B)/%乙醇-水體積(C)/mL乙醇-水比例(D)/%綜合評分1280(1)0.3(1)40(1)13(1)51.32280(1)0.5(2)50(2)14(2)73.63280(1)0.7(3)60(3)15(3)63.84300(2)0.3(1)50(2)15(3)68.15300(2)0.5(2)60(3)13(1)56.46300(2)0.7(3)40(1)14(2)70.87320(3)0.3(1)60(3)14(2)72.18320(3)0.5(2)40(1)15(3)64.79320(3)0.7(3)50(2)13(1)57.4R162.90063.83362.26755.033R265.10064.90066.36772.167R364.73364.00064.10065.533Rj2.2001.0674.10017.134

根據表1中極差Rj值，各因素對異甘草素聚乳酸納米粒包封率影響大小順序為D>C>A>B。根據Rn(n為1，2或3)，最佳組合為A2B2C2D2，即聚乳酸用量為300 mg，poloxamer 188濃度為0.5%，乙醇-水體積為50 mL，乙醇-水比例為1：4。根據方差分析結果(表2)，因素D即乙醇-水比例差異有統計學意義(P<0.01)。按照優化后的處方工藝制備3批異甘草素聚乳酸納米粒，結果顯示，包封率為(74.94±1.18)%。

表2 方差分析結果

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.0。

2.4異甘草素聚乳酸納米粒基本性質

2.4.1載藥量、粒徑分布及Zeta電位 按照“2.2”項下測定方法，測得異甘草素聚乳酸納米粒載藥量為(8.45±0.66)%。取異甘草素聚乳酸納米粒混懸液，純化水稀釋，置于比色池中。測定聚乳酸納米粒粒徑和Zeta電位(圖1，2)。測定結果顯示，異甘草素聚乳酸納米粒平均粒徑為(190.22±3.09) nm，多分散性指數(polydispersity index,PDI)為0.149±0.039；Zeta電位為(-12.5±0.27) mV。

圖1 異甘草素聚乳酸納米粒的粒徑分布

Fig.1Particlesizedistributionofisoliquiritigenin-loadedpolylacticacidnanoparticles

圖2 異甘草素聚乳酸納米粒的Zeta電位

Fig.2Zetapotentialofisoliquiritigenin-loadedpolylacticacidnanoparticles

2.4.2異甘草素聚乳酸納米粒體外釋藥行為 取異甘草素原料藥混懸液及其聚乳酸納米粒混懸液2 mL，異甘草素含有量均為2 mg，置于經處理好的透析袋中，兩端扎緊。避光操作，以 2.0%十二烷基硫酸鈉溶液150 mL為溶出介質，轉速設置為100 r·min-1，溫度為(37±1)℃。分別在0，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24，36和48 h取外液2.0 mL，及時補充2.0 mL的空白釋放介質。測定各時間點的藥物含量，并計算各時間點的累積釋放度，繪制體外溶出曲線(圖3)。由結果可知，將異甘草素制備成聚乳酸納米粒后，體外釋藥具有明顯的緩釋釋藥特征。

圖3 異甘草素及其聚乳酸納米粒的體外釋放曲線(n=3)

Fig.3Invitroreleaseprofilesofisoliquiritigeninanditspolylacticacidnanoparticles(n=3)

2.4.3釋藥模型擬合 對異甘草素聚乳酸納米粒體外釋藥分別采用零級、一級、Higuchi及Weibull模型進行擬合，研究發現(表3)，制備的異甘草素聚乳酸納米粒體外釋藥模型符合Weibull模型：LnLn[1/(1-Mt/M∞)]=0.519 4Lnt-1.391 9(r=0.972 8)。

表3 藥物釋放模型和相關系數

Tab.3Drugreleasemodelandcorrelationcoefficient

模型擬合方程R2零級模型Mt/M∞=0.021 1t+0.208 40.731 7一級模型Ln[1/(1-Mt/M∞)]=-0.049 8 t-0.251 10.914 6Higuchi模型Mt/M∞=0.139 9 t1/2+0.098 90.941 6Weibull模型LnLn[1/(1-Mt/M∞)]= 0.519 4Lnt-1.39190.972 8

Mt為t時間累積釋放度；M∞為∞時累積釋放度；Mt/M∞為t時間累積釋放百分率；t為時間。

Mtis accumulative release at time t；M∞is accumulative release at time ∞；Mt/M∞is accumulative release percentage at timet；tis time.

2.5藥動學研究

2.5.1血漿樣品的處理 精密量取血漿樣品100 μL和內標溶液50 μL置于具塞尖底離心管中，加入甲醇1.5 mL，以沉淀蛋白，渦旋混合4 min，8000 r·min-1離心15 min(r=7.7 cm)。轉移上清液，40 ℃氮氣吹干有機溶劑。殘留物加入100 μL流動相復溶，8000 r·min-1離心10 min(r=7.7 cm)，后進高效液相色譜儀測定藥物含量[11-12]。

2.5.2對照品溶液的配制及標準曲線的繪制 配制濃度為10 μg·mL-1異甘草素對照品溶液，進一步稀釋、配制濃度分別為50.0，100.0，250.0，500.0和1000.0 ng·mL-1的系列異甘草素的血漿樣品。另精密配制濃度為200 ng·mL-1苯甲酸鈉內標溶液。以異甘草素和苯甲酸鈉峰面積比(Y)與異甘草素濃度(X)進行線性回歸，得出線性回歸方程為Y=0.060 7X+0.021 4(r=0.999 3)。由相關系數r可知，在50.0～1000.0 ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

2.5.3方法學驗證 以異甘草素的低(50.0 ng·mL-1)、中(500.0 ng·mL-1)、高(1000.0 ng·mL-1)濃度考察日內精密度RSD值。結果顯示RSD值分別為7.28%，4.36%和5.11%(n=3)。考察5 d的日間精密度，3種濃度RSD值分別為10.53%，6.80%和7.74%(n=3)。取大鼠空白血漿100 μL，分別配制低、中、高濃度的異甘草素血漿溶液，按“2.4.1”項下方法進行處理。由回歸曲線求出測定濃度，與實際濃度比較。結果顯示3種濃度的回收率分別為89.61%，93.57%和92.94%(n=3)。其中，3種濃度的RSD值<7.11%。任取一份血漿樣品，置于-20 ℃冰箱中于5 d內反復融凍，高效液相色譜(HPLC)測定血藥濃度變化，結果顯示，血藥濃度的變化差異無統計學意義(P>0.05)。因此，血漿樣品5 d內反復融凍時穩定性較好。

2.5.4給藥方案及樣品采集 取SD大鼠隨機分為2組，每組6只。實驗室適應2 d，禁食，自由飲水。按60 mg·kg-1灌胃異甘草素原料藥混懸液和異甘草素聚乳酸納米粒混懸液。分別于0，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10和12 h各時間點眼眶采血約0.3 mL，置于肝素化處理后的離心管中。以轉速為3500 r·min-1離心2 min。分取上層血漿，于-20 ℃冰箱冷凍保存，測定前復溶[10-11]。

2.5.5藥動學曲線及主要參數 分別測定異甘草素及其聚乳酸納米粒血漿樣品血藥濃度，繪制藥動學曲線。達峰濃度(Cmax)和達峰時間(tmax)采用實測值，藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)采用梯形法計算。藥動學曲線結果見圖4及表4。異甘草素聚乳酸納米粒tmax提前，但差異無統計學意義(P>0.05)；Cmax由(436.86±90.46) ng·mL-1顯著提高至(750.55±109.36) ng·mL-1；t1/2由(2.34±0.55) h延長至(3.81±0.72) h，表明聚乳酸納米粒顯著提高了藥物在體內循環時間；AUC0-t由(1449.13±233.41) ng·mL-1·h極顯著提高至(2463.88±408.17) ng·mL-1·h，口服吸收生物利用度提高至170.02%。

圖4 異甘草素及其聚乳酸納米粒的平均藥物濃度-時間曲線(n=6)

Fig.4Meanplasmaconcentration-timecurvesofisoliquiritigeninanditspolylacticacidnanoparticles(n=6)

3 討論

異甘草素聚乳酸納米粒系采用改良的自乳化溶劑擴散法進行制備，推測形成納米粒的過程為：在攪拌的條件下，將溶有異甘草素和載體的油相加入到含乳化劑的水相中，水溶性溶劑自發擴散，大大降低了兩相之間的表面張力，同時產生界面騷動，最終形成納米級別的乳滴。隨著有機溶劑的不斷揮發，納米級別乳滴從水相中逐漸析出。由于異甘草素分子結構中有3個羥基與苯環直接相連，具有較強的極性，容易與聚乳酸分子結構中羰基形成氫鍵[13-14]，增強了兩者的親和力，乳滴固化后成為聚乳酸納米粒。可以看出，載體和藥物能否從水相中同步析出，是影響包封率的影響因素之一。由于載體聚乳酸在乙醇不溶，而在丙酮溶解度較好。在丙酮體積不變的情況下，通過調整乙醇有機溶劑的比例，進而使載體和藥物能近乎同步從水相中析出形成納米粒。這也解釋了正交實驗考察結果中乙醇-水比例對異甘草素聚乳酸納米粒包封率具有極顯著性差異的原因。劉月新等[15]制備的吡喹酮聚乳酸納米粒包封率僅為46.74%，這可能與有機溶劑(丙酮/乙醇)比例不合適有關。因此，除了藥物/載體比、油相/水相體積比、表面活性劑濃度等因素會影響聚乳酸納米粒包封率外[15-16]，有機溶劑的比例也是需要重點考察的因素之一。本研究對高包封率的聚乳酸納米粒的研究有一定的借鑒意義[17]。

表4 異甘草素及其聚乳酸納米粒的主要藥動學參數

Tab.4Mainpharmacokineticparametersofisoliquiritigeninanditspolylacticacidnanoparticles

項目tmaxt1/2hCmax/(ng·mL-1)AUC0-tAUC0-∞(ng·mL-1·h)異甘草素2.08±0.312.34±0.55436.86±90.461449.13±233.411576.06±245.36異甘草素聚乳酸納米粒1.67±0.343.81±0.72①750.55±109.36①2463.88±408.17①2603.43±431.70①

①與異甘草素原料藥比較，t=0.000 439，0.000 812，0.001 547，0.004 284，P<0.01。

①Compared with crude isoliquiritigenin，t=0.000 439，0.000 812，0.001 547，0.004 284，P<0.01.

制備的異甘草素聚乳酸納米粒粒徑分布均勻，體外釋藥模型符合Weibull模型。體內藥動學顯示，聚乳酸納米粒使異甘草素的Cmax顯著提高；AUC0-t顯著提高，口服吸收生物利用度明顯提高，為異甘草素的藥理活性提高奠定基礎。本研究成功制備了粒徑較小、包封率較高、帶負電荷性質的聚乳酸納米粒，為進一步研究異甘草素聚乳酸納米粒結構修飾[18-20]，提高腫瘤靶向效果等奠定了實驗基礎[21]。