不同土壤中鎘對大麥和多年生黑麥草毒性閾值的研究①

王子萱，陳宏坪，李 明，楊新萍

不同土壤中鎘對大麥和多年生黑麥草毒性閾值的研究①

王子萱，陳宏坪，李 明，楊新萍

(南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095)

根據不同終點、不同農田土壤的植物毒性測試可為基于生態毒理效應的土壤鎘(Cd)環境質量標準值的修訂提供基礎數據。以大麥和黑麥草為供試植物，研究了中國14種不同農田土壤，添加多水平外源Cd對大麥根的相對伸長量和黑麥草的發芽率、地上部生物量的影響，并結合Log-Logistic分布函數模型確定不同土壤中大麥和黑麥草Cd毒性的劑量-效應關系和毒性閾值(EC50、EC10)，也測定了黑麥草地上部的Cd含量。結果表明，外源Cd含量在0 ~ 200 mg/kg時，大麥根長隨土壤Cd含量的增加顯著降低，EC50值為7.8 ~ 61.7 mg/kg，EC10值為0.2 ~ 5.4 mg/kg，均與土壤pH顯著正相關。外源Cd含量在0 ~ 500 mg/kg時，黑麥草地上部生物量隨土壤中Cd含量的增加呈先上升(5 mg/kg)后下降(≥ 25 mg/kg)趨勢，EC50值為29.7 ~ 499.7 mg/kg，EC10值為4.4 ~ 200.0 mg/kg，二者與土壤性質均無顯著相關性。與對照相比，外源Cd含量為5 ~ 25 mg/kg時，外源添加Cd對黑麥草種子發芽有促進作用，當外源Cd含量為500 mg/kg時，僅有5種土壤中種子發芽率明顯下降。黑麥草地上部Cd含量隨著外源Cd含量(0 ~ 100 mg/kg)的增加而顯著升高。黑麥草地上部對土壤Cd的富集程度與土壤pH極顯著負相關。黑麥草具有作為草坪草中Cd污染修復植物的潛力。大麥對土壤Cd污染脅迫比黑麥草更為敏感，總體上，pH是影響土壤Cd植物毒性的重要因素。

鎘；大麥；多年生黑麥草；毒性閾值；超積累植物

我國耕地土壤污染嚴重。據2014年發布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，我國土壤總點位超標率為16.1%，耕地土壤點位超標率為19.4%(相當于2 600萬hm2)。從污染物超標情況看，Cd污染點位超標率為7.0%，占據第一位[1]。此外，近30 a來，我國土壤中的Cd含量急劇增加，年平均增加0.004 mg/kg，遠高于歐洲地區(年平均增加0.000 33 mg/kg)[2]。按照這種增長速率，50 a后我國土壤Cd含量將增加一倍[3]。

Cd具有極高的生物毒性，在土壤中遷移性很強，易通過植物根系的吸收在植物體內積累，不僅會抑制植物生長發育、影響植物的品質和產量，還可能經過食物鏈進入人體，對人類的健康造成嚴重威脅[4-5]。因此，進行土壤Cd的生態風險評價十分重要。通過評價土壤Cd 生態風險，計算Cd毒性閾值，為控制Cd進入土壤系統提供量化指標，并為土壤環境質量Cd標準的修訂提供依據。另外通過研究生物體對土壤Cd的解毒過程，或可為Cd污染土壤的修復提供基礎數據[6]。建立污染物的劑量-效應關系是評價污染物生態風險的主要途徑之一[7]，對此國內外已有不少報道：Rooney{Rooney, 2006 #10;Rooney, 2007 #11}等[8-9]建立了Cu和Ni對西紅柿和大麥毒害的生態毒理學模型；林春野[10]研究比較了Cu、Cd、Zn對小麥和油菜的生態毒性及2種植物對3種重金屬的毒性敏感性；陳世寶等[11]進行了基于不同測試終點的土壤Zn毒性的研究。但由于污染物對植物的劑量-效應關系可能隨著土壤性質、測試終點的變化而變化，具有很大的不確定性，而土壤種類、測試終點的選取直接影響著污染物風險評價的結果。因此，開展不同土壤、基于不同測試終點的毒理學評價對于 Cd 污染土壤的環境風險評價具有重要意義。

大麥(L.)是我國種植的主要作物之一，具有較高的食用價值和經濟價值。同時它也是一種Cd敏感糧食作物[12]。多年生黑麥草(L.)為禾本科多年生草本植物，是重要的栽培牧草和綠化植物[13]。大麥和黑麥草常被用作毒理試驗材料[12, 14]。重金屬對植物有深遠的毒害影響，致使植物在種子萌發、幼苗生長和結實等不同生長發育階段都可能受到毒害作用。本文選擇我國具有寬廣pH范圍(4.77 ~ 8.24)的14種土壤，利用大麥和黑麥草2種植物開展植物毒害試驗，以大麥根長、黑麥草發芽率及黑麥草地上部生物量作為評價指標，研究了在不同土壤條件下，不同Cd含量水平對2種植物的毒害作用及其敏感性，得到基于各評價指標的Cd毒性閾值，并與土壤理化性質建立聯系，以期為我國土壤Cd污染的生態風險評價、管理與土壤環境質量標準的修訂提供數據支持。另外，許多研究指出{徐衛紅, 2006 #41;Rooney, 2007 #3}[13, 15]，多年生黑麥草對土壤Cd有較強的富集作用，具有成為修復材料的潛力。因此，本研究也評價了不同土壤條件下黑麥草對土壤Cd的富集能力，為我國Cd污染土壤的植物修復提供修復材料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

在全國14個地區采集土壤樣品(表1)，其中酸性土壤 (pH<6.5) 8種、中性土壤 (6.5 ≤pH<7.0) 2種、堿性土壤 (pH≥7.0) 4種。土壤Cd含量0.03 ~ 1.56 mg/kg，這些土壤代表了我國主要土壤類型，且土壤性質差異很大。土壤采集后自然風干，去除石子、草根等雜質，過4 mm篩，裝入桶中于室溫下保存。另取少量樣品過2 mm和0.15 mm篩，分別用于土壤理化性質常規分析和Cd含量測定。

表1 供試土壤基本理化性質

土壤pH使用玻璃電極按土水比1︰2.5測定；根據重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定土壤有機質含量 (soil organic matter，SOM)；陽離子交換量(cation exchange capacity，CEC)采用氯化鋇緩沖液法測定[16]；土壤機械組成使用激光粒度儀測定。供試土壤基本理化性質見表1。

1.2 植物毒害試驗

根據國際標準組織(international organization for standardization，ISO)標準方法，采用大麥和黑麥草分別進行植物根長試驗(ISO 11269-1)[17]和生長試驗(ISO 11269-2)[18]。

1.2.1 老化處理 在14份風干土壤(過4 mm篩)中添加不同濃度的外源Cd，Cd以CdCl2(CdCl2·2.5H2O，分析純) 溶液形式加入土壤中，設置8個Cd添加水平：0、2.5、5、10、25、50、100、200 mg/kg(以Cd元素計)，每個處理3次重復，將土壤拌勻。當外源Cd添加水平為0 mg/kg時，土壤Cd含量為各土壤Cd本底值，即對照處理。

李傳飛等[19]、吳曼等[20]研究表明，外源添加的Cd進入土壤后，其穩定化作用主要發生在前15 d，因此確定土壤老化時間為2周。老化處理結束后，每份土壤取少量(過0.15 mm篩)，測定其Cd含量。

植物毒害試驗于玻璃溫室內進行，每日光照12 h，溫度控制在(25 ± 2)℃。

1.2.2 大麥根長試驗 將飽滿均一的大麥 (L.)栽培品種 “Baudin” 種子置于30℃恒溫培養箱催芽，待種子胚芽露白(胚根< 2 mm)后，播種于塑料管(φ45 × 100 mm)中。為保證空氣交換，塑料管底部留4個小孔。每根塑料管5顆種子，用去離子水保持土壤水分為田間持水量的60%，培養5 d后從塑料管中完整取出發芽的大麥，記錄每株大麥的最長根長，以同一塑料管5株大麥的最長根長的平均值作為一個重復，每個外源Cd處理下，共有3個塑料管，即3個重復。

1.2.3 黑麥草Cd毒害試驗 正式試驗前進行黑麥草盆栽試驗的預試驗，設置8個Cd添加水平：0、5、10、25、50、100、200、500 mg/kg(以Cd元素計)。黑麥草種植于塑料盆缽 (φ100 × 90 mm) 中，盆底墊紗網以防土壤漏出。挑選健康飽滿的多年生黑麥草()“Derby” 商品種子20顆，均勻播種在土壤表層，用去離子水澆灌，土壤水分保持在田間持水量的60%。出芽后每盆定植10株，培養30 d后，剪下黑麥草地上部(離土面0.5 cm)，用去離子水洗凈擦干并記錄鮮物質量。然后置于65 ℃烘箱(Memmert, UNE-500 / UNE-600，德國)烘干至恒重，記錄干物質量。

1.3 土壤、植物 Cd 含量測定

植物樣品加入5 ml 混酸(HNO3/HClO4，87/13，/，優級純)，使用石墨爐消解儀(SH220，上海海能)消解[21]。土壤樣品加5 ml王水(HCl/HNO3，4/1，/，優級純)，使用同上石墨爐消解儀消解[22]。植物、土壤Cd含量采用電感耦合等離子質譜儀 ICP-MS (PERKIN-ELMER，NexION 300X，美國) 測定。分析過程中加入土壤(GBW 07428)及植物 (GBW 10015) 標準物質進行質量控制。Cd回收率分別為103% ~ 109% 和91% ~ 108%。

1.4 數據分析

數據統計和方差分析使用Excel 2007和SPSS statistics 20，采用SigmaPlot 12.5繪圖，數據離散程度以標準差SD表示。

Cd 毒性閾值采用EC(effective concentration)表示，劑量效應使用Log-logistic曲線擬合, 擬合方程如下：

式中：為各處理濃度下相對根伸長/相對生物量(%)，即Cd處理組大麥根長或黑麥草地上部生物量與對照組的比值，為外源Cd的添加水平 (mg/kg)。0,,為擬合參數，為毒性閾值 EC(mg/kg)。為10、50時，分別表示EC10、EC50，即大麥根伸長或黑麥草地上部生物量受到10%、50% 抑制時的土壤Cd含量。

2 結果

2.1 土壤 Cd 對大麥根長的影響

對老化后的土壤進行Cd含量檢驗，土壤Cd含量實測值與外源添加Cd水平極顯著線性相關，相關系數> 0.995 (< 0.01)，表明外源添加Cd水平較好地反映了土壤實際Cd含量。

14份土壤理化性質見表1。除廣西河池(Cd = 1.56 mg/kg)、廣西崇左(Cd = 0.34 mg/kg)、湖南湘鄉(Cd = 0.44 mg/kg)外，其他地區土壤Cd含量均低于國家土壤環境質量二級標準(GB15618—1995)。14個地區的土壤對照處理間比較，大麥根長差異顯著(< 0.01)，與土壤CEC呈顯著負相關(= –0.616，0.05)。外源添加Cd含量為2.5 mg/kg時，與對照相比，除廣東肇慶、福建泉州和安徽合肥土壤中大麥根生長不受影響外，其余土壤中大麥根生長均受到抑制。外源添加Cd含量≥5 mg/kg 時，大麥根長急劇下降。與對照相比，外源添加Cd含量達到200 mg/kg時，對大麥根生長的抑制 > 70%，其中以江西鷹潭土壤抑制率最顯著，高達89%(圖1)。圖1為Log- logistic模型方程擬合的大麥相對根長與土壤外源添加Cd含量的劑量效應曲線(2> 0.90,< 0.01)。

2.2 土壤 Cd 對黑麥草生長的影響

2.2.1 土壤Cd 對黑麥草發芽率的影響 由圖2可知，外源添加Cd含量為5 ~ 25 mg/kg時，與對照相比，外源添加Cd處理對黑麥草種子發芽有促進作用。外源添加Cd含量為 50 ~ 200 mg/kg時，發芽率緩慢下降。當外源添加Cd含量為500 mg/kg時，江西鷹潭、廣東肇慶、廣東韶關、遼寧沈陽、山東臨朐土壤中種子發芽率下降明顯，與對照相比，抑制率分別為92%、41%、33%、34% 和14%。而其余9份土壤中種子發芽率基本不受影響。

2.2.2 土壤 Cd 對黑麥草生物量的影響 由圖3可知，外源添加Cd含量為5 mg/kg時，與對照相比，Cd處理均促進了黑麥草地上部的生長，其中福建泉州土壤上黑麥草生物量增加最高，達到了48%。當外源添加Cd含量達25 mg/kg時，除廣西河池、湖北宜昌、福建泉州和山東臨朐土壤的黑麥草生物量仍高于對照土壤外，其余10份土壤黑麥草生長均受抑制，江西鷹潭土壤上黑麥草生物量下降最顯著，抑制率為58%。外源添加Cd含量為 25 ~ 500 mg/kg時，黑麥草生物量隨土壤Cd含量增加而呈現下降趨勢。與對照相比，外源添加Cd含量達500 mg/kg時，江西鷹潭、廣東韶關和福建泉州土壤上黑麥草完全死亡，而其他11種土壤上黑麥草生長的抑制率均大于40%。

圖1 大麥相對根長與土壤外源添加Cd含量的劑量效應曲線

(同一地區數據小寫字母不同表示不同外源Cd處理間差異達到P<0.05顯著水平)

2.3 Cd 對大麥與黑麥草的毒性效應

2.3.1 Cd對兩種植物毒性指標的EC50值 14份土壤中外源Cd對大麥根長的毒性閾值變異很大，EC50值為7.8 ~ 61.7 mg/kg，相差7.9倍；EC10值為0.2 ~ 5.4 mg/kg，相差28.9倍。由Pearson相關性分析(表2)可知， EC50值與土壤pH顯著正相關(= 0.788，<0.01)，而與 CEC、SOM、砂粒含量等土壤性質沒有顯著相關性。EC10與其呈現相似規律，與土壤pH顯著正相關(= 0.615，< 0.05)，與其他土壤性質無顯著相關性。土壤pH解釋了大麥EC50值62.1% 的變異，EC10值37.8% 的變異。這說明土壤pH是影響Cd生物毒性的主要因素之一。

圖3 黑麥草地上部相對生物量與土壤外源添加Cd含量的劑量效應曲線

表2 兩種植物EC50值與土壤理化性質的Pearson相關性分析

注：* 表示相關性達到<0.05顯著水平，**表示相關性達到<0.01顯著水平，括號中為值，下表同。

對黑麥草地上部生物量而言，14份土壤中外源Cd的毒性閾值差異顯著，EC50值為29.7 ~ 499.7 mg/kg，相差16.9倍；EC10值為4.4 ~ 200.0 mg/kg，相差45.4倍。Pearson相關性分析(表2)表明，黑麥草地上部EC50、EC10值與各土壤性質相關性均不顯著(> 0.05)。

2.3.2 黑麥草對 Cd 的積累 黑麥草Cd含量與土壤Cd全量線性方程見表3(由于高Cd含量時部分黑麥草生長受到嚴重抑制，收獲的地上部數量不足以后續的Cd含量分析，因此這里取擬合的最高土壤外源添加Cd含量為100 mg/kg)，兩者表現出極顯著的線性相關(<0.05)。以方程斜率值表征黑麥草對Cd的富集能力。在酸性土壤(4.77≤pH≤6.48)中，值為0.87 ~ 3.91；堿性土壤(7.28≤pH≤8.24)中，值為0.53 ~ 0.75。

Pearson相關分析(表4)表明，值與土壤 pH 在<0.01水平上極顯著負相關，即土壤 pH 為4.77 ~ 8.24時，黑麥草對Cd的富集能力隨pH升高而降低。

表3 黑麥草地上部 Cd 含量與土壤 Cd 全量線性擬合方程

表4 黑麥草富集系數k 值與土壤理化性質的 Pearson 相關性分析

3 討論

一般認為，低含量的Cd對種子萌發、幼苗生長有刺激效應，高含量的Cd則表現出抑制效應。本試驗中，土壤中外源添加Cd含量為5 ~ 25 mg/kg時，觀察到黑麥草種子發芽率、地上部生物量高于對照，而高Cd含量處理下(25 ~ 500 mg/kg)，黑麥草生長受到抑制。馮鵬等[23]、李慧芳等[24]的研究也觀察到類似現象。孫聰等[25]的研究也表明，外源Cd含量分別為1.2和4.8 mg/kg時，水稻生物量最高，比對照增加4% ~ 56%。這可能是由于低含量Cd提高胚的生理活性，促進了種子萌發；而高含量Cd對胚、芽產生傷害作用，且抑制了淀粉酶、蛋白酶活性[26]。與此不同的是，在低含量Cd處理下，Cd對大麥幼根的生長表現為抑制作用。這說明Cd脅迫對根的抑制大于芽，這與楊明等[27]、周青等[26]研究結果相同。

不同物種、不同品種的植物對土壤Cd毒害的響應不同，丁楓華等[28]研究了23種作物對Cd毒害的敏感性差異，發現不同作物地上部鮮重EC50有較大差異；宋文恩等[29]針對3種水稻品種開展了根長試驗，指出不同品種在同一種土壤上，EC50、EC10均存在較大差異。本試驗中大麥根長EC50值為7.8 ~ 61.7 mg/kg，EC10值為0.2 ~ 5.4 mg/kg，黑麥草地上部生物量EC50值為 29.7 ~ 499.7 mg/kg，EC10值為4.4 ~ 200.0 mg/kg。14份土壤中，除湖南湘鄉土壤外，大麥EC50值均低于黑麥草；所有土壤中大麥EC10值比黑麥草EC10值更低。這說明大多數土壤條件下，大麥對Cd生物毒性的響應比黑麥草更為靈敏。

大量研究表明，土壤性質對固相Cd吸附、液相Cd形態有著顯著影響[30-32]，從而影響Cd的可利用性，其中pH是最重要的因素之一[33-35]。和軍強等[36]研究表明，pH為影響HC5(保護95% 稻米品種的土壤Cd限值)的最主要因子，可控制HC5變異的62.2%。一般來說，Cd的溶解度隨pH升高而下降，因此堿性土壤中Cd的生物有效性較低[2, 37-38]。根據經驗，下降1個單位的土壤pH可能使土壤Cd的可利用性增加1.5倍[2]。本試驗中不同土壤大麥根長和黑麥草地上部生物量的 EC值變異很大，EC50分別相差7.9和16.9倍，EC10值分別相差28.9和45.4倍。這說明利用EC10的統計不確定性高于EC50，與已有研究結果相同[29, 39]。相關性分析表明大麥根長EC50、EC10值與土壤pH呈顯著正相關，土壤pH越低，EC值越低，植物越容易受到Cd脅迫。且由于EC50的變異性更小，因此EC50與土壤性質之間的相關性比EC10更強。宋文恩等[29]通過根長試驗指出水稻毒性閾值 EC與土壤pH呈正相關，與本研究內容一致。因此在評價土壤中Cd的生物毒性時，應充分考慮土壤性質之間的差異。但本試驗中基于黑麥草生物量EC值與土壤性質無顯著相關性，因此土壤性質對黑麥草的作用可能更為復雜。

研究表明植物地上部Cd含量主要取決于土壤中Cd含量，另外也受到土壤性質的影響[40-41]{范中亮, 2010 #35;Zhu, 2016 #7}。本試驗中，隨著土壤Cd含量的升高，Cd在黑麥草地上部的積累增加，且兩者線性相關。方程斜率值與土壤pH顯著負相關。當土壤pH<6.5時，值為0.87 ~ 3.91；土壤pH≥6.5時，值為0.53 ~ 0.95，即一般情況下，在酸性土壤中，黑麥草對Cd的富集能力要強于堿性土壤。本試驗中，每一盆黑麥草收割一茬可以從土壤中移除0.05 ~ 124 μg Cd(黑麥草地上部干物質量×Cd含量)。經過多次刈割，可以逐步減少土壤中Cd含量。由于黑麥草具有先鋒植物特性和可以多次刈割并再生的特點[23]，且黑麥草對Cd具有很強的抗性，對Cd有富集作用，因此黑麥草對Cd污染土壤的修復有著很好的應用前景。

4 結論

1)在不同測試終點下，土壤Cd的毒性閾值有較大差異，敏感順序為大麥根長>黑麥草地上部生物量，大麥對Cd的生物毒性的響應比黑麥草更為靈敏。

2)不同土壤條件下Cd對植物的毒性閾值有較大差異，大麥根相對伸長量的EC50、EC10值與土壤pH呈顯著正相關。而Cd對黑麥草的毒性閾值變異性更大，與土壤性質無顯著相關性。

3)黑麥草地上部Cd積累量隨著土壤Cd含量升高而增加。黑麥草對Cd的富集能力與土壤 pH顯著負相關，在酸性土壤中，黑麥草對Cd的富集能力更強，黑麥草具有對Cd污染土壤的修復潛力。

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Toxicity Thresholds of Cadmium to Barley and Perennial Ryegrass as Determined by Root-Elongation and Growth Tests in Soils

WANG Zixuan, CHEN Hongping, LI Ming, YANG Xinping

(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The toxicity thresholds of Cd to higher plants in various soils are determined using root-elongation, emergence and growth of higher plants tests with the aim of providing fundamental data for the revision of soil environmental quality standards of Cd in soils of China. Fourteen different soils with various properties and barley and perennial ryegrass were selected in this study, the dose-response curves and the toxicity thresholds were investigated using Log-Logistic distribution models based on the ISO 11269-1 root-elongation test and on the ISO 11269-2 emergence and growth of higher plants test in soils. Cd concentrations in shoot of the ryegrass seedlings were also determined in this study. The results indicated that the relative root elongation (%) of barley significantly decreased with the increase of Cd concentrations (0-200 mg/kg) in soils. The half inhibiting concentration (EC50) and the 10% effect concentration (EC10) of Cd to the relative root elongation of barley varied significantly from 7.8 to 61.7 mg/kg and from 0.2 to 5.4 mg/kg among the tested soils, respectively. The values of EC50and EC10increased obviously with rising soil pH. In the test range (0–500 mg/kg Cd) the shoot biomass of perennial ryegrass increased at lower concentrations (5 mg/kg) and then significantly decreased at higher concentrations (≥ 25 mg/kg). The EC50and the EC10of Cd to the shoot biomass of perennial ryegrass varied significantly from 29.7 to 499.7 mg/kg and from 4.4 to 200.0 mg/kg among the tested soils, respectively. There was no correlation between soil factors and the EC50or EC10of Cd to the shoot biomass of ryegrass in soils.Lower concentrations of Cd (5–25 mg/kg) promoted seed germination of perennial ryegrass, but when Cd concentration was more than 50 mg/kg there was slightly inhibition of seed germination and the inhibition peaked when Cd concentration was 500 mg/kg in five of the studied soils. Soil pH was found to be the major property influencing Cd accumulation in shoots of ryegrass. In general, Cd sensitiveness of barley is higher than perennial ryegrass which represents hyper-accumulative ability for Cd, soil pH is the main soil factor affecting Cd toxicity to higher plants in soils. The conclusions of this study could provide reference for plants breeding on Cd contaminated soil.

Cadmium,Barley, Perennial ryegrass, Toxicity threshold, Hyper-tolerant grass

公益性行業(農業)科研專項(201403014)資助。

xpyang@njau.edu.cn)

王子萱(1993—)，女，山西晉中人，碩士研究生，主要從事環境污染控制研究。E-mail: 2015103055@njau.edu.cn

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A

10.13758/j.cnki.tr.2019.06.015