食源性病毒分子生物學檢測技術研究

食源性病毒是由食物引起導致人類發生疾病的病毒， 主要通過糞－口途徑傳播， 食用被污染的食品、水，含病毒的排泄物和嘔吐物均可導致感染。 常見的食源性病毒包括諾如病毒、甲肝病毒、豬瘟病毒、輪狀病毒、冠狀病毒等。 早期的食源性病毒檢測方法主要有電鏡觀察法、酶聯免疫法等，但檢出率不高，有較大的局限性。而分子生物學方法靈敏度高，特異性強，能快速、靈敏、準確地檢測臨床標本中的食源性病毒，推動了病毒的流行病學研究。

分子生物學檢測步驟主要包括樣本的前處理方法、 核酸提取方法和核酸擴增檢測技術等。 王之瑩等（2020）研究了利用側流核酸試紙條快速檢測非洲豬瘟病毒，其將傳統聚合酶鏈式反應(PCR)與膠體金試紙條技術結合，開發一種低成本的側流核酸測定試紙條(LFNAA)。該體系設計了獨特的尾引物，避免了傳統核酸試紙條的半抗原標記及抗體的使用。 經過PCR 擴增后產生一端帶著單鏈寡核苷酸尾巴的雙鏈DNA 產物，能夠與膠體金標記的寡核苷酸捕獲探針結合，從而在試紙條上形成可以用肉眼觀察的目標產物。 該技術可進一步結合等溫擴增技術， 能夠在食品安全和醫學診斷中實現更快更簡便的現場檢測。 張彩虹等（2019）根據非洲豬瘟病毒(ASFV)保守的VP72 基因序列，設計特異性引物和探針，經過優化反應體系中各組分及反應條件，建立了直接檢測樣品中ASFV 的熒光定量PCR 方法，并分析該方法的特異性和敏感性。孫亞萍等（2008）建立適用于牡蠣和糞便中快速、特異、靈敏的GⅠ、GⅡ型諾如病毒(NV)定量分型診斷方法。 方法：通過對GⅠ、GⅡ型NV 基因組保守序列的比對分析,設計高度特異的引物和探針,建立以TaqMan探針為基礎的實時聚合酶鏈反應方法(TaqMan Real-time RT-PCR)。 中國專利 CN200880021273.7 公開了一種改良的諾如病毒RNA 檢測方法，其包括以下工序：使用下述引物對中的至少兩組，通過逆轉錄酶，生成包含啟動子序列的雙鏈DNA，所述引物對為：由對于與諾如病毒的各個基因型的RNA 相同或者互補的核酸序列雜交效率高的第一引物和第二引物(該引物中的任意一者的5′末端附加有啟動子序列)組成的引物對；以該雙鏈DNA 作為模板，通過RNA 聚合酶生成RNA 轉錄產物；該RNA 轉錄產物繼續作為利用所述逆轉錄酶合成DNA 的模板，生成所述雙鏈DNA。 在所述RNA 擴增工序中，通過用嵌入劑性熒光染料標記的核酸探針測定被擴增的RNA 轉錄產物量。 CN201911302311.2 公開一種非洲豬瘟病毒的鎖核酸探針熒光定量PCR 檢測組合物、檢測方法及檢測試劑盒，該發明的檢測引物、探針和檢測試劑盒，利用鎖核酸的特點，設計含有鎖核酸的特異性探針，該探針對DNA 有強大的識別能力和強大的親和力，從而能夠很好地應用于非洲豬瘟病毒精準檢測，提高了非洲豬瘟病毒的檢測效率。 CN201910963376.5 涉及一種非洲豬瘟病毒熒光定量PCR 檢測試劑盒，所述試劑盒包括：緩沖液B1、緩沖液B2、PCR 反應液、陽性對照和陰性對照；緩沖液B1 快速裂解樣品，釋放病毒核酸；緩沖液B2：用于穩定提取的病毒核酸，消除對PCR 反應的抑制作用；PCR 反應液： 由2×Premix Ex TaqTM 酶混合液和ASFV 特異性的上下游引物以及熒光探針組成， 其中酶混合液中添加有Tli RnaseH。 該發明使用易于裂解的兩種緩沖體系直接對樣品中的核酸DNA進行裂解，不僅大大減少了樣品提取核酸DNA 的時間和操作步驟，節省了檢測時間，且適于運輸和保存。CN201810155282.0 公開了一種非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測試劑盒， 包括ASFV-反應液、DNA 酶混合液、ASFV-內標、ASFV-陽性對照、ASFV-陰性對照、核酸釋放劑以及ASFV-定量參考品，所述ASFV-反應液包括：引物：ASF03F03 和 ASF03R03；內標引物：IPC05F01 和 IPC05R01；探針 ASF03P 和內標探針 IPC05P；所述引物和探針對應于非洲豬瘟病毒p72 基因的高度保守片段。N201310629121.8 公開一種檢測豬瘟病毒的RT-LAMP 核酸試紙條試劑盒及應用。該試劑盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6 所示的引物組和核酸檢測試紙條。 使用方法如下：首先配制RT-LAMP 反應體系，包含AMV 逆轉錄酶、一倍反應緩沖液、鏈置換DNA 聚合酶、dNTP 混合物、 甜菜堿、MgSO4、FIP 引物、BIP 引物、Probe 雜交探針、LoopB 引物、F3 引物、B3引物以及待測樣品RNA；恒溫反應所得產物用核酸檢測試紙條檢測后直接進行判讀：陽性結果為出現兩條紅色條帶，一條位于檢測區內，另一條位于質控區內。該試劑盒操作簡單、成本低廉，反應結果易于觀察，特異性好，易于大范圍推廣應用。

食源性病毒作為引發食品安全事件的主要病原受到廣泛關注， 開發食源性病毒的便攜式快速檢測方法具有重大的實際意義。研究人員可通過恒溫檢測方法結合新型納米材料、試紙條、電化學傳感器、微流控芯片等方式，實現更快捷、更通用、更便攜的食源性病毒核酸檢測，保障食品安全。