苗期甘蔗氮高效基因型評價指標的篩選

楊柳　廖芬　MuhammadANAS　李強　彭李順　黃東亮　李楊瑞

摘 ?要：本研究通過低氮壓力選擇，篩選出甘蔗氮高效種質，分析影響甘蔗氮高效的重要指標，為甘蔗氮高效育種及栽培提供理論依據(jù)。以58份甘蔗種質資源為材料，在苗期采用正常供氮（2 mmol/L N）和低氮（0.2 mmol/L N）處理，分析甘蔗植株形態(tài)、干重及氮素在各器官中累積分配的特征。通過主成分分析方法篩選影響甘蔗氮高效利用的重要指標，通過聚類分析對58份種質進行聚類。結果表明，低氮（0.2 mmol/L N）處理可以明顯從植物形態(tài)區(qū)分不同種質的氮利用差異，58份種質低氮條件下的干重范圍為0.64～14.75 g/株，氮累積量為5.53～63.00 mg/株，氮利用率范圍為115.40～279.30 g/g。對低氮壓力下甘蔗干重及氮累積等25個指標進行主成分分析后，提取出4個主要成分，總貢獻率為92.35%。通過高、低氮條件下與氮利用效率有關的氮轉移系數(shù)及基因潛力等19個指標分析后提取出5個主成分，總貢獻率為82.21%。影響甘蔗氮高效的重要指標有甘蔗的干重（全株、葉、根）、氮累積量（全株、葉、莖）、氮利用率（全株、葉）、葉的相對氮利用率、莖的基因潛力、莖的相對干物質量和莖的相對氮累積量。經(jīng)聚類分析后初步將58份甘蔗種質分為氮高效基因型、偏氮高效基因型、偏氮低效基因型和氮低效基因型。

關鍵詞：甘蔗;種質;苗期;氮高效;篩選指標

中圖分類號：S566.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Screening of Sugarcane with High Nitrogen Efficiency at Seedling Stage

YANG Liu1， LIAO Fen1*， Muhammad ANAS2， LI Qiang2， PENG Lishun3， HUANG Dongliang1， LI Yangrui1*

1. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture & Rural affairs， Nanning， Guangxi 530007， China; 2. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 3. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： The purpose of the experiment is to screen high nitrogen use efficiency （NUE） genotypes under a low nitrogen pressure selection system. Furthermore， the important indexes which affecting the NUE of sugarcane were analyzed. The results could provided a theoretical basis for the high NUE breeding and cultivation of sugarcane. In the study， seedlings of 58 sugarcane genotypes were evaluated in a hydroponic experiment with low-N （0.2 mmol/L N） and normal-N （2 mmol/L N） treatment. The growth， dry biomass and N cumulative and distribution characteristic in various organs were evaluated according to descriptive statistic， principal component analysis and cluster analysis. The results indicated that morphology， biomass， nitrogen efficiency traits showed high genotypic variation for N treatments. Under low-N treatment， the dry biomass of 58 genotypes varied from 0.64 to 14.75 g/plant， nitrogen accumulation was from 5.53 to 63.00 mg/plant and NUE was from 115.40 to 279.30 g/g. Four factors were extracted with variance contribution approximated to 92.35%， according to 25 parameters such as dry biomass and N uptake with N deficiency. And another five factors were extracted with variance contribution approximated to 82.21%， according to 19 parameters under both normal and low N treatment such as nitrogen transfer coefficient， genetic potential. The data revealed that dry biomass （whole plant， leaf， root）， N uptake （whole plant， leaf， shoot）， NUE （whole plant， leaf）， leaf relative NUE， shoot relative dry weight， shoot relative N uptake， shoot genetic potential were the key factors that involved in sugarcane high NUE. 58 sugarcane genotypes were clustered into four group： high NUE group， slightly higher NUE group， slightly lower NUE group and low group.

2 ?結果與分析

2.1 ?不同氮水平對甘蔗苗期生長的影響

在正常供氮條件下，各甘蔗種質生長茂盛，葉色濃綠，枯葉極少出現(xiàn)（圖1A）;低氮壓力篩選條件下，各甘蔗種質很快表現(xiàn)出生長緩慢，植株普遍小于正常供氮條件下，下部葉多出現(xiàn)黃化，隨時間的推移，上部綠葉也出現(xiàn)脈間黃化等缺氮癥狀（圖1B）。不同種質對低氮脅迫反應在表型上存在較大的差異，主要表現(xiàn)為植株的大小、綠葉數(shù)量及下部葉片黃化程度的差異。說明以0.2 mmol/L的氮作為甘蔗低氮脅迫的壓力是可靠的，在這一壓力水平下，各甘蔗種質表現(xiàn)了缺氮癥狀，且生長勢又表現(xiàn)出明顯差異，同時也說明甘蔗苗期的表型性狀可以作為甘蔗氮高低效種質篩選指標之一。

2.2 ?不同氮水平下甘蔗氮利用各指標間的變異分析

甘蔗低氮條件下測定及計算后所得各指標數(shù)據(jù)見表2，與氮利用效率有關的各指標數(shù)據(jù)見表3，從表2和表3可見，甘蔗各性狀指標之間相差非常大，表現(xiàn)出不同程度的變異，甘蔗干重、氮累積、氮利用效率等25個指標的變異系數(shù)為18.70%～58.83%（表2），甘蔗氮轉運系數(shù)、基因潛力、相對干物質重量、相對氮利用率等19個指標的變異系數(shù)為7.35%～182.63%（表3）。甘蔗葉、莖、根及總體的干重及氮累積的變異系數(shù)較大（40.33%～58.83%），甘蔗低氮條件下氮轉運系數(shù)及莖的基因潛力、相對干生物重、相對氮累積量的變異系數(shù)均在90%以上，說明這些指標靈敏度較高，可以作為不同基因型甘蔗氮高效的篩選指標。

2.3 ?甘蔗苗期氮高效種質評價指標的篩選

利用主成分分析法，對低氮壓力下甘蔗干重及氮累積等25個指標（表2）和與氮利用效率有關的氮轉移系數(shù)及基因潛力等19個指標（表3）進行提取，獲得結果見表4。從表4可見，在低氮壓力下甘蔗的25個指標中提取了4個主要成分，其累積貢獻率達到92.354%，其中第1成分貢獻率為55.50%，指向的性狀指標主要是總干重（TDW）、總氮積量（TNuptake）、葉和根干重（LDW和RDW）、葉和莖的氮累積量（Nuptake）、莖的偏肥生產(chǎn)力（PFP）和氮吸收效率（UpE），這些指標在第1主成分中的荷占比均達到90%以上;成分2貢獻率為17.465%，指向的指標主要是總氮利用率（TiNUE）和葉的氮利用率（LiNUE），荷占比分別為95.3%和90.0%;成分3貢獻率為14.26%，指向的指標主要是根偏肥生產(chǎn)力（RPFP，荷占比89.8%）以及根的氮吸收效率（RUpE，荷占比86.9%）;成分4貢獻率為5.129%，指向的指標主要是葉偏肥生產(chǎn)力（LPFP，荷占比61.0%）。在低氮壓力選擇下，第1主成分和第2主成分貢獻率最大，累積達到72.965%，其中在成分荷載矩陣中占比最重要的是總干重、總氮累積量、葉和根干重、葉和莖的氮累積量、莖的偏肥生產(chǎn)力、氮吸收效率、總氮利用率和葉的氮利用率，這幾個指標在第1和第2成分主成分中的荷載超過90%以上，說明這幾個指標最能代表不同基因型甘蔗對氮素的響應狀況。

同時考慮低氮和正常氮條件下各指標時，從與氮效率相關19個指標中提取5個主要成分，累積貢獻率達到82.213%，其中第1成分貢獻率為25.511%，指向的性狀指標主要是葉和根的相對氮利用率、低氮條件下總氮轉運系數(shù)，荷占比分別為93.1%和86.3%;成分2貢獻率為21.508%，指向的性狀指標主要是總基因潛力、莖的基因潛力、莖相對干物質重、莖相對氮累積，荷占比分別為75.2%、95.5%、97.1%和94.5%;成分3貢獻率為16.58%，指向的性狀指標主要是總相對地上部地下部干重比、根基因潛力、根相對氮累積、根相對干物質重，荷占比分別為80.1%、90.7%、90.7%和82.8%;成分4貢獻率為11.354%，指向的性狀指標主要是葉基因潛力、葉相對氮累積、葉相對干物質重，荷占比分別為83.0%、83.1%和82.8%;成分5貢獻率為7.26%，指向的性狀指標主要是莖相對氮利用率，荷占比為80.7%。有文獻[21]報道，只有在低氮和正常氮或是高氮條件下均可以保持較高的氮利用率的材料，才是典型的氮高效材料，因此，篩選評價指標的時候，應該也考慮低氮和正常氮下的各指標，進行綜合評價。在同時考慮低氮和正常氮條件下提取的5個主成分中，以第1和第2主成分的貢獻率較高，它們所指向的指標中，葉的相對氮利用率、莖的基因潛力、莖相對干物質重、莖相對氮累積荷占比在90%以上，說明這些指標能反應甘蔗在低氮和正常氮條件下的氮利用狀況。

在實際操作中，干重和氮累積量的指標測定易于操作，葉取樣更方便、快速，因此，全株的總干重、總氮累積量、總的氮利用率、葉的干重、葉氮累積量、葉氮利用率、葉的相對氮利用率作為評價指標會更方便快速，而主成分分析的結果也表明這幾個指標的貢獻率和荷占比均較高，適合作為甘蔗氮高效的評價指標。

2.4 ?不同氮利用效率甘蔗種質的聚類分析

為更好的評價不同種質的氮利用效率，根據(jù)主成分分析結果，以在第1主成分和第2主成分中占權重較大的甘蔗總干重、總氮累積、總氮利用率、葉的相對氮利用率等4個指標作為聚類的主要指標，采用平方歐式距離法對58份甘蔗基因型進行聚類分析（圖2，表5），根據(jù)聚類分析結果，發(fā)現(xiàn)58份種質分成了4個主要類群，進一步分析了這4個類群的總干重、總氮累積、總氮利用率、葉的相對氮利用率等的數(shù)據(jù)之后（表5），發(fā)現(xiàn)4個類群的各指標之間存在顯著差異，根據(jù)各類群氮利用率將58份甘蔗基因型分成4類，氮高效基因型（Ⅰ型）、偏氮高效基因型（Ⅱ型）、偏氮低效基因型（Ⅲ型）和氮低效基因型（Ⅳ型）。氮高效基因型有Co1149、CC92-85、CP02-1143等19份種質，占所有種質數(shù)量的32.77%;偏氮高效基因型有RB88-5054、Q202、GT37等10份種質，占所有種質數(shù)量的12.24%;偏氮低效基因型有GT29、GT31、RB92-2579等12份種質，占所有種質數(shù)量的20.69%;氮低效基因型有GT11、YaCheng96-40、GXS79-9等17份種質，占所有種質數(shù)量的29.31%。

從表5看，Ⅰ型～Ⅳ型之間的氮利用效率平均值分別為221、189、159、153 g/g，氮高效基因型材料的氮利用率顯著高于氮低效基因型材料。不同類型種質之間的干重、莖PFP和葉氮利用率也存在明顯差異，氮利用率高的種質，干重、莖PFP和葉片氮利用率也相應明顯較高。而葉的相對氮利用效率正好相反，說明氮高效的種質材料葉的氮利用率在正常供氮時，可以保持很好的氮利用率，氮低效的種質材料在正常供氮的條件下葉片的氮利用效率較低。

3 ?討論

作物氮高效種質篩選是氮高效品種選育以及獲得典型種質的前提條件，作物產(chǎn)量，外觀形態(tài)，根、莖、葉等器官生物量及氮累積量等指標均與氮利用效率相關，主成分分析法和聚類分析法相結合，篩選影響作物氮利用效率的關鍵指標，在苦蕎[22]、煙草[15]、花生[13]等作物上得到了驗證，這些研究為甘蔗氮利用指標的篩選提供了參考。

在本研究中，與甘蔗氮利用相關的指標共有44項，這些指標分別反映了甘蔗全株和根、莖、葉各器官在低氮條件下生長的氮利用以及在高、低氮條件下氮利用潛力等特征，通過主成分分析之后，確定了不同指標對甘蔗氮利用的影響程度如下：在低氮條件下，莖氮累積量、根干重、總氮累積、莖氮吸收效率、莖PFP、葉干重、總干重、葉氮累積>總氮利用率、葉氮利用率>根的PFP、根的UpE;結合高低氮條件共同分析，各指標對甘蔗氮利用的重要關系如下：葉的相對氮利用率>莖的相對干物質重、莖的基因潛力、莖的氮累積量>根的基因潛力、根的相對干物質量>葉的相對干物質重、葉的基因潛力、葉的氮累積量>莖的相對氮利用率，這些指標的總貢獻率在72%以上，可見這幾個指標對甘蔗氮利用有非常重要的影響。本研究結果與前人的相似，前人的研究表明玉米的生物量[23-24]、完熟期時的全株干重、吐絲期時的穗三葉氮含量、花前氮的累積量[25]可作為玉米氮高效篩選的重要指標。Krishna等[26]的研究表明，水稻葉、莖、根的生物量及根長是評價水稻氮高效的重要指標。小麥的耐低氮指標也主要指向莖、葉的相對干重、相對吸氮量和干重[27-28]。在本研究中，以第1、第2成分主成分中荷載比較大的干重、氮累積量、氮利用率及葉片相對氮利用率為主要指標，進行聚類分析后，發(fā)現(xiàn)58份甘蔗種質可以明顯分為4個類群，且4個類群的氮利用率、干重和氮累積量也有顯著差異（表5），說明主成分分析及聚類分析確實可以較好篩選影響甘蔗氮高效的重要指標，并且可以較好地將不同種質進行分類。

在本研究中，選用了2類指標進行主成分分析，以低氮試驗下的25個指標進行主成分分析時，提取到4個主成分的累積貢獻率達到92.35%，而以正常、低氮條件均考慮的19個指標進行主成分提取時，提取到的5個主成分的累積貢獻率僅為82.21%，可見低氮試驗的各指標作為甘蔗氮高效的評價指標會更適合。甘蔗收獲的主要是營養(yǎng)體——莖稈，與谷類作物小麥、水稻、玉米等以收獲籽粒為主的作物不同，本研究選用的甘蔗材料為生長138 d的苗期材料，甘蔗已經(jīng)開始拔節(jié)，此時甘蔗吸收的氮素營養(yǎng)會占到全生育期的一半左右[29]，因此以該生長期的甘蔗為材料可以反映評價甘蔗氮利用狀況。

本研究結果表明甘蔗的生長形態(tài)、干重、氮累積、氮利用效率等可以作為甘蔗氮高效的篩選指標，本研究僅是在室內盆栽進行了試驗，今后仍需在大田條件下進行田間實驗以進一步驗證室內試驗的結果。在本研究中將58份種質分成了4類不同氮利用效率類型，但也發(fā)現(xiàn)氮利用率最高的種質與最低的種質只相差2倍左右，今后還需要進一步擴大篩選種質的范圍，以期找到氮利用效率更高的種質。此外，對篩選出來的氮利用較高的幾份種質，下一步需進行其氮吸收特征的研究，以期能更深入了解甘蔗氮高效利用的可能機制，為甘蔗的栽培及氮高效種質選育提供參考。

致 ?謝 ?特別感謝廣西甘蔗種質資源圃段維興在種質材料提供方面給予的幫助。

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收稿日期 ?2018-11-29;修回日期 ?2019-05-08

基金項目 ?國家自然科學基金項目“甘蔗氮高效基因型種質資源篩選及其高效機制研究”（No. 31601249）;廣西農業(yè)科學院基本業(yè)務經(jīng)費項目（No. GNK 2019M20）;熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室開放課題“甘蔗氮高效基因型種質篩選”項目（No. 1630032017020-7）。

作者簡介 ?楊 ?柳（1983—），男，博士，副研究員，研究方向：甘蔗氮素高效利用。*通信作者（Corresponding author）：李揚瑞（LI Yangrui），E-mail：liyr5745@126.com;廖 ?芬（LIAO Fen），E-mail：liaofen@gxaas.net。