分光光度法估算經皮內窺鏡下腰椎椎間盤切除術中出血量

夏 宇，晏錚劍，高 翔，王可然，杜 宇，唐鍇鷹，張 汛，陳 亮

重慶醫科大學附屬第二醫院骨科，重慶 400010

經皮內窺鏡下腰椎椎間盤切除術（PELD）作為治療腰椎椎間盤突出癥（LDH）的一種新興技術，具有創傷小、對脊柱穩定性影響小、患者術后恢復快等優點［1-4］，但由于PELD在水介質中進行，術中持續沖洗導致術中出血被大量稀釋，尚無法準確估算術中出血量。分光光度法是以氰化高鐵血紅蛋白測定為基礎，通過測定其光密度（OD）值來計算血紅蛋白濃度，是國際血液學標準委員會（ICSH）推薦使用的血紅蛋白測定方法，對于低濃度的血紅蛋白亦可準確測定，目前測定血紅蛋白濃度所使用的其他方法均需用此法驗證及校準［5］。本研究采用分光光度法測量術中沖洗液的OD值，以氰化高鐵血紅蛋白標準液繪制標準曲線，據此計算術中出血量［6］，為PELD術中出血量的估算提供一種相對準確的方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2018年3月—10月，本院采用PELD治療LDH患者62例（排除中途轉開放手術、術中沖洗液未完全收集、有嚴重基礎疾病、手術前后資料缺如的患者），手術均由同一組醫師完成，其中男28例、女34例，年齡（51±13）歲。分別使用分光光度法、血紅蛋白計算法、目測法估算術中出血量。記錄患者術前和術后血紅蛋白濃度、術中沖洗液體積等數據。

1.2 方法

1.2.1 分光光度法原理

血紅蛋白中的亞鐵離子（Fe2+）被高鐵氰化鉀氧化為高鐵離子（Fe3+），血紅蛋白轉化為高鐵血紅蛋白（Hi）。Hi與氰化鉀中的氰離子反應生成氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）。HiCN最大吸收波峰為540 nm，波谷為504 nm［7］。在特定條件下，HiCN在540 nm處的OD值與濃度成正比［8-9］，根據測得的OD值可求得血紅蛋白濃度［10-11］。

本研究使用的HiCN標準液（上海榕柏生物科技有限公司）有4個標準濃度，分別為50、100、150、200 g/L，使用UV6100型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）測定HiCN標準液在540 nm處的OD值，以標準液濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線（圖1a）。由于預實驗中發現標本中血紅蛋白濃度范圍為1.0 ～ 6.0 g/L，故將100 g/L的標準液稀釋成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 g/L的標本，測量其在540 nm處的OD值，繪制標準曲線，所得曲線線性關系良好（圖1b）。將圖1a與圖1b合并，得到合并后標準曲線（圖1c）作為本研究的標準曲線。使用臨床輸血用懸浮紅細胞驗證標準曲線在本研究中的可行性，選取10份懸浮紅細胞標本，測定血紅蛋白濃度，分別取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mL，稀釋至2 000 mL，測定其OD值，與標準曲線中相應濃度對應的OD值比較，驗證分光光度法的可行性。

圖1 分光光度法估算出血量的標準曲線Fig. 1 Standard curve of spectrophotometry in estimating blood loss

1.2.2 標本處理及出血量估算

分光光度法：術前抽取患者靜脈血5 mL備用。術前吸引器瓶中預先加入肝素抗凝，術中使用一次性防水單及產科剖宮產用防水貼膜，防止沖洗液漏至無菌單或臺下。術中使用的所有沾血紗布均用生理鹽水反復沖洗至基本無色。使用吸引器確保收集術區所有沖洗液及血液，術后將沖洗液標本充分混勻，采用臨床用一次性輸血器過濾（紅細胞平均直徑7 μm，濾網孔徑170 μm）［12-13］，在保證濾除椎間盤纖維組織、脂肪、韌帶組織等雜質的同時保證血紅蛋白的完整性。取沖洗液標本，使用血紅蛋白測定試劑盒HiCN法處理后測定其在540 nm處的OD值，根據標準曲線測出沖洗液中血紅蛋白濃度，同時測定患者術前靜脈血中血紅蛋白濃度，計算出血量。出血量（mL）=沖洗液標本血紅蛋白濃度（g/L）×沖洗液總體積（mL）/術前血紅蛋白濃度（g/L）。

血紅蛋白計算法：術前、術后均抽取患者靜脈血5 mL，送血常規檢查，以血紅蛋白每下降5 g/L為失血200 mL［14］，通過術前與術后血常規中血紅蛋白的濃度差得出術中出血量。

目測法：術后憑主刀醫師及另外2名有多次此類手術經驗的醫師通過肉眼觀察術中沖洗液顏色估計出血量，取3人估計出血量的平均值作為目測法結果。

1.3 統計學處理

采用SPSS 24.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

以生理鹽水稀釋后的不同濃度懸浮紅細胞標本作為檢測對象，測定的OD值與標準曲線中相應濃度對應的OD值比較差異均無統計學意義（P＞0.05），說明標準曲線可用于低濃度血紅蛋白測定，分光光度法用于測定沖洗液中血紅蛋白濃度是準確可行的。

患者術前血紅蛋白濃度為（127.0±18.3）g/L，術后血紅蛋白濃度為（121.9±17.8）g/L，術中沖洗液量為（1 704±388）mL。分光光度法測得沖洗液中血紅蛋白濃度為（3.93±1.92）g/L，據此估算術中出血量為12.30 ～ 164.33（51.85±27.48）mL ；血紅蛋白計算法估算的術中出血量為40 ～ 960（216.00±155.91）mL；目測法估計的術中出血量為5 ～ 100（32.17±20.11）mL；3種方法測得術中出血量差異均有統計學意義（P＜ 0.05），其中目測法估計的出血量低于分光光度法，血紅蛋白計算法估算的出血量高于分光光度法。

3 討 論

術中出血量是衡量手術效果的一項重要指標，但目前尚缺乏測量PELD術中出血量的詳細方法。在既往文獻中，常規開放手術術中出血量的評估方法是計算術前與術后血紅蛋白的差值，此法簡便易行，但影響因素過多（術中補液、機體應激、術中麻醉藥物的使用、術后體液再分布等）［15-16］，精確度偏低，應用于出血量較大的傳統開放手術時誤差尚可接受，而PELD的微創特性，術中出血對血紅蛋白水平的影響并不十分明顯，此法并不適用。此外，PELD術中出血量小且被沖洗液大量稀釋，難以直接收集血液進行計算，加之沖洗液中血紅蛋白濃度極低，超出了臨床檢驗常用的血細胞分析儀的最低檢出限度，無法使用血細胞分析儀直接測算［17］。目前，對于PELD術中出血量主要依靠主刀醫師根據沖洗液的顏色進行估算，這種目測法估計出血量主要依賴于主刀醫師的個人經驗，誤差很大，實際出血量常比目測法測得量高［18］，且各醫師由于經驗及認知水平不同，對沖洗液顏色及其相對應出血量的判斷不盡相同，在臨床工作中很難形成量化的標準。

本研究采用分光光度法，以HiCN法為基礎，將術中收集的所有含有血液的沖洗液均勻混合后作為標本，可準確測得標本中血紅蛋白濃度，進一步計算得到出血量，可提高估算的準確性。為保證將誤差控制在可接受范圍內，本研究采取了一系列措施：①為避免儀器本身的測量誤差，每次測定OD值前均使用符合ICSH標準的HICN標準液進行儀器校正。②由于術中各階段出血量不同，術中必須全程收集并使血液與沖洗液均勻混合以保證結果的準確性。故本研究術中使用產科剖宮產用手術貼膜及一次性防水單，以保證術中標本不會漏至無菌單上或手術臺下，同時使用沖洗液將術中沾血的紗布洗滌至無色以保證術中出血盡可能被完全收集。③標本凝固將使測量產生明顯誤差，本研究組在吸引器瓶中預先使用肝素，可有效防止凝血。④本方法的原理是測量標本的OD值，術中產生的雜質如椎間盤、脂肪、韌帶等組織將使測得的OD值偏大，使用臨床用一次性輸血器過濾沖洗液可有效避免雜質對標本OD值的影響，同時可保證紅細胞完全通過輸血器濾網（紅細胞平均直徑為7 μm，濾網孔徑為170 μm）。為保證估算的準確性，本研究操作較為繁瑣，今后仍需進一步探討更簡便且嚴謹的方法以迅速估算PELD術中出血量，并確保進一步減少實驗誤差。

本研究驗證了分光光度法計算PELD術中出血量的可行性，且此方法并不局限于這一手術方式，還可用于估算其他以水為介質的微創手術術中出血量，如膀胱鏡、各種關節鏡、頸椎經椎間孔入路內窺鏡技術、經皮腎鏡等。準確估算術中出血量是評價手術創傷大小、比較不同術式療效差異、指導術后康復治療的重要指標，分光光度法可較為準確地估算PELD術中出血量，為臨床工作中評估出血量提供了一個量化標準和新的選擇。