鹽脅迫下大麥酵母雙雜交文庫的構建與鑒定

李穎波，宗營杰，劉成洪，陸瑞菊，黃劍華，杜志釗，許建華，王亦菲*

（1上海市農業科學院生物技術研究所，上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海201106；2上海市農業科技服務中心，上海200335；3光明種業有限公司，上海202171）

隨著氣候變遷和化肥的大量使用，我國農業生產中土壤鹽漬化問題越來越突出［1］。鹽脅迫顯著抑制作物生長速度，降低分蘗和分枝數量，甚至致死，最終影響作物產量［2］，已成為制約我國農作物生長與產量的重要因素之一。以往研究表明，植物的耐鹽機制主要由滲透調節、離子平衡和抗氧化3種方式組成［2］。

受到高濃度鹽離子脅迫后，一方面，植物在細胞質中積累多種次生代謝產物，如糖醇類、糖類、氨基酸及其衍生物、胺類和硫酸酯膽堿等，以增加細胞滲透能力，抵抗鹽脅迫造成的細胞內滲透壓改變［3］；另一方面，植物通過細胞內的離子通道、質子泵和轉運蛋白等相關蛋白的作用將Na＋轉運到液泡內隔離或外排，同時植物的抗氧化系統能清除鹽脅迫下產生的大量活性氧、自由基等強氧化性物質［3］。目前研究發現，SOS基因家族、HKT基因家族和NHX基因家族在細胞Na＋平衡上起著關鍵作用［4-7］。但是，植物對鹽脅迫的抗性是一個復雜的生理過程，植物應對鹽脅迫反應中許多信號途徑仍有待闡明，研究鹽脅迫下植物細胞中的信號途徑和蛋白互作網絡，將有助于提高對鹽脅迫下信號轉導途徑的認識。相對于其他禾本科作物，大麥對鹽的耐受性特別是組織耐受性較強，同時大麥也是遺傳學研究中廣泛應用的模式作物之一，且在國民經濟生產發展中具有十分重要的地位。因此，研究大麥耐鹽機制，不僅對我國大麥耐逆育種的進一步發展具有重要的理論意義和應用價值，也對研究其他禾本科作物的耐鹽性具有重要的參考價值。

酵母雙雜交是利用酵母遺傳學分析蛋白質之間相互作用的方法，已廣泛用于蛋白質組學、細胞信號轉導和功能基因組學等領域［8］。酵母雙雜交不但可以檢測已知蛋白之間的相互作用，而且可以發現已知蛋白的互作蛋白，并且可以發現蛋白的新功能。近年來，研究者已在小麥、水稻、大麥、玉米等許多重要農作物中構建了不同組織、器官的酵母雙雜交cDNA文庫［9-11］，為相關作物的蛋白質組學研究奠定了基礎。本實驗室前期獲得了與鹽脅迫相關的E3泛素連接酶基因，擬采用酵母雙雜交技術篩選其互作靶蛋白，研究其在大麥耐鹽反應中的作用通路。

本研究以鹽脅迫下的不同大麥組織為材料，利用Gateway技術構建鹽脅迫下的大麥酵母雙雜交cDNA文庫，以期為深入研究植物應對鹽脅迫信號網絡提供更多理論支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料和鹽脅迫處理

供試材料為‘花30’，是上海市農業科學院生物技術研究所細胞工程研究室育成的大麥品種。‘花30’種子浸泡12 h露白后，挑取發芽一致的種子播于盆缽中培養（晝/夜溫度為22℃/20℃，相對濕度70%，晝/夜光周期為14 h/10 h）。當幼苗處于2葉1心期時，盆缽中加入400 mg/L的NaCl溶液進行處理。在不同的處理時間（0 h、24 h、48 h），分別剪取根、莖、葉，迅速置于液氮中冷凍，-80℃冰箱保存。

1.2 菌株和載體

大腸桿菌 DH10B、酵母菌株 Y187、文庫載體 pDONR222、pGADT7-DEST均購自 Invitrogen公司（美國）。

1.3 主要試劑

Trizol Reagent、CloneMiner cDNA Library Construction Kit、FastTrack MAG mRNA Isolation Kit、UltraPureTMPhenol∶Chloroform∶Isoamyl alcohol（體積比25∶24∶1）購自 Thermo公司（美國）；氨芐青霉素、卡那霉素購自Sigma公司（美國）；DL2000 DNA Marker、Taq DNA Polymerase購自Takara公司（日本）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4 大麥總RNA的提取和mRNA的分離

參照李穎波等［12］方法提取鹽脅迫后的大麥根、莖和葉的總RNA。將根、莖和葉的總RNA按照濃度1∶1∶2混合后分離mRNA。mRNA分離參照FastTrack MAGmRNA Isolation Kit說明書進行。分離的mRNA經質量及純度檢測后，用于后續的文庫構建。

1.5 酵母雙雜交初級cDNA文庫的構建

初級cDNA文庫構建參照 CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書進行。將純化得到的mRNA進行cDNA第1鏈、第2鏈的合成及純化，加重組接頭attB1 Adapter。將cDNA利用Gateway技術與文庫載體質粒pDONR222混合進行BP重組反應；重組反應產物經Proteinase K處理、純化，利用電轉化法轉入大腸桿菌DH10B；加入1 mL SOC培養基，37℃培養1 h，即為cDNA初級文庫菌液；加甘油至終濃度為20%（V/V），-80℃保存備用。

1.6 酵母雙雜交次級cDNA文庫的構建

次級cDNA文庫構建參照CloneMiner cDNA Library Construction Kit說明書進行。將得到的cDNA初級文庫菌液接種于含有相應抗性的LB液體培養基中，30℃過夜培養后抽提質粒，稀釋質粒終質量濃度至300 ng/μL。取出1μL質粒，與文庫載體質粒pGADT7-DEST混合進行LR重組反應；反應產物經Proteinase K處理、純化，利用電轉化法轉入大腸桿菌DH10B。收集單克隆，加入3 mL SOC培養基，37℃培養1 h，即為酵母雙雜交次級cDNA文庫菌液；加甘油至終濃度為20%（V/V），-80℃保存備用。

1.7 酵母文庫構建

將次級cDNA文庫菌液接種于含有相應抗性的LB液體培養基中，30℃過夜培養后提取質粒。將5μg文庫質粒用PEG/LiAc法轉入酵母菌株Y187中，涂布于SD/-Leu平板上。于28℃培養3—6 d后收集單克隆，加甘油至終濃度為50%（V/V），-80℃保存。

1.8 文庫庫容量鑒定

分別從1.5、1.6和1.7轉化后的文庫原液中取10μL（酵母文庫取100μL），稀釋1 000倍（酵母文庫菌液稀釋10 000倍），吸出50μL（酵母文庫涂100μL）涂布于含有相應抗性的LB平板上（初級文庫使用卡那霉素抗性、次級文庫使用氨芐青霉素抗性、酵母文庫使用SD/-Leu平板），37℃培養12—16 h（酵母文庫28℃培養2—3 d）后進行統計。文庫滴度（CFU/mL）＝克隆數×稀釋倍數/涂板體積；文庫總容量（CFU）＝文庫滴度×文庫總體積。

1.9 文庫插入片段長度和重組率鑒定

從各級文庫LB抗性平板上隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，初級文庫菌落PCR使用的引物分別是 M13Forward（5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’）和 M13Reverse（5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’），次級文庫和酵母文庫菌落PCR使用的引物分別是pDEST22Forward（5’-TCGATGATGAAGATACCCCACC-3’）和pDEST22Reverse（5’-TCGATGATGAAGATACCCCACC-3’）。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃3 min，30個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物用0.8%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測，統計陽性克隆重組率，并鑒定插入片段長度。

2 結果與分析

2.1 大麥總RNA提取、m RNA純化和dscDNA合成

提取NaCl溶液脅迫后的大麥品種‘花30’根、莖、葉的總RNA，用1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28S和18S條帶明亮清晰，表明該總RNA完整性好，未發生降解（圖1A）。分離純化混合后的總RNA樣品得到mRNA，電泳檢測mRNA質量，結果顯示分離純化的mRNA在較大范圍內呈彌散狀分布（圖1B），表明mRNA質量良好。將mRNA反轉錄合成dscDNA，電泳顯示dscDNA呈彌散狀（圖1C），片段分布較廣。

圖1 大麥總RNA、m RNA和dscDNA電泳鑒定Fig.1 Electrophoresis of total RNA，mRNA and dscDNA of barley

2.2 初級cDNA文庫構建和質量鑒定

將dscDNA和pDONR222載體重組，重組產物轉入大腸桿菌中，獲得初級cDNA文庫。從初級cDNA文庫中取10μL原始菌液稀釋1 000倍，取50μL涂布于LB抗性平板上，37℃培養12—16 h后單克隆數為1 500個。經計算，文庫滴度為3.0×106CFU/mL，初級cDNA文庫總克隆數為1.2×107個。隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，電泳結果顯示，僅1個克隆呈陰性，其余為陽性克隆，重組率為95.8%，插入片段長度多為500—2 000 bp，插入片段平均長度大于1 000 bp（圖2）。

圖2 初級文庫cDNA插入片段的PCR檢測Fig.2 PCR detection of inserted cDNA fragments in primary library

2.3 次級cDNA文庫構建和質量鑒定

將初級cDNA文庫搖菌提取質粒，并稀釋至300 ng/μL。以pGADT7-DEST為目的載體，LR重組反應后轉入大腸桿菌DH10B中，獲得次級cDNA文庫。從次級cDNA文庫中取10μL原始菌液稀釋1 000倍，取50μL涂布于LB抗性平板上，37℃培養過夜后的單克隆數為1 300個。經計算，文庫滴度為2.6×106CFU/mL，次級cDNA文庫總克隆數為1.04×107個。隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，電泳結果顯示，除1個克隆呈陰性外，其余均為陽性克隆，重組率為95.8%，插入片段多為500—2 000 bp，插入片段平均長度大于1 000 bp（圖3），具有較好的多態性。

圖3 次級文庫cDNA插入片段的PCR檢測Fig.3 PCR detection of inserted cDNA fragments in secondary library

2.4 出芽酵母雙雜交文庫的構建和質量鑒定

將次級cDNA文庫搖菌提取質粒，取5μg轉入酵母菌株Y187中，涂布于SD/-Leu平板上，收集單克隆獲得酵母雙雜交文庫。從酵母文庫原始菌液中取100μL，稀釋10 000倍后涂布于SD/-Leu平板上，28℃培養2—3 d后單克隆數為700個。經計算，文庫滴度為7.0×107CFU/mL。隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR，電泳結果顯示全部為陽性（圖4）。

圖4 酵母雙雜交文庫cDNA插入片段的PCR檢測Fig.4 PCR detection of inserted cDNA fragments in yeast two hybrid library

3 討論

高質量酵母雙雜交文庫是進行大規模互作蛋白篩選，獲得陽性互作蛋白的前提［13］。本研究提取了鹽脅迫后的大麥根、莖、葉的總RNA，并將其混合后用于構建酵母雙雜交cDNA文庫，防止了文庫中組織特異性表達基因的丟失。

評價文庫質量有兩個重要指標，即cDNA文庫的庫容量和重組序列的完整性［14］。本研究分離純化后得到的mRNA呈彌散狀，具有較高的純度和完整性，保證了后續文庫構建質量。Clarke等［15］研究表明，滿足低豐度mRNA篩選要求的最低文庫滴定濃度為1.0×106CFU/mL。本研究中初級cDNA文庫滴度為3.0×106CFU/mL，次級cDNA文庫滴度為2.6×106CFU/mL，插入片段平均長度大于1 000 bp，表明所構建的cDNA文庫覆蓋度和和完整性良好，可滿足常規文庫篩選要求。酵母雙雜交篩選主要有共轉化和交配兩種方法，其中交配法的效率相對較高［16］。本研究在次級cDNA文庫的基礎上，構建了大麥酵母雙雜交文庫，可以最大程度地保證篩選到所有的與靶蛋白具有相互作用的蛋白質分子。