超臨界CO2萃取印蒿精油工藝優化及成分分析

丁仡，李源棟，劉秀明，尹開云，邱杰斐，夏建軍，楊義，段焰青，*

（1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南昆明650202；2.湘潭大學化學學院，湖南湘潭411100；3.昆明香冠科技有限公司，云南昆明650202；4.紅云紅河煙草（集團）有限責任公司，云南昆明650202）

印蒿（Artemisia palls Wall.）歸屬于菊科植物蒿屬，始于印度南部地區，其具有持久的特征微弱膏香和藥香草本植物[1]。印蒿油的主要來源來自印蒿花采用水蒸餾所得，作為食品香料來源，已被多國引進，目前主要用于調配葡萄干、海棗、果脯、桃子、李子等香精[2]。目前國內外關于印蒿精油成分組成報道文獻較少[3-6]，這對了解印蒿精油揮發性成分組成和應用有一定的局限性。

植物油提取方法有很多種，有著各自優缺點，其中水蒸氣蒸餾法[7]，蒸汽溫度過高、易使物質分解且耗能大；溶劑提取法[8]，精油中含有雜質、耗時長、溶劑用量大且難回收；微波輔助提取[9-10]，可能導致揮發油成分發生變化；壓榨法[11]會將部分雜質溶于精油中；超臨界流體萃取法相比于其他方法可以避免對成分的破壞，避免水解，對活性成分提取更完全，且采用CO2為萃取溶劑，具有無毒，廉價以及來源豐富等特點，廣泛用于植物油的提取[12-14]。本研究首次采用超臨界流體萃取法提取不同產地印蒿的揮發油，通過探討不同操作因素對萃取效果影響，并采用氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法結合保留指數對印蒿油進行成分分析，為其開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

印蒿：市場；二氯甲烷、甲醇、正己烷（優級純）：百靈威科技有限公司；正構烷烴C7～C30：Sigma-Aidrich 公司。

1.1.2 儀器與設備

ZX-FW80 高速萬能粉碎機：北京中興偉業儀器有限公司；HELIX 超臨界流體萃取儀：Applied separations Inc 公司；RE-52A 型旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI 公司；7890A/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent 公司；ME414S 萬分之一電子天平：德國Sartorius 公司。

1.2 方法

1.2.1 超臨界萃取

取30 g 印蒿用粉碎機進行粉碎并過40 目篩選，干燥后將其放入萃取釜。開通CO2，選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時間，收集精油，并通過公式計算出精油的得率。

萃取率/%=（精油質量/印蒿干粉質量）×100

1.2.2 單因素試驗設計

設定萃取壓力為25 MPa，CO2流量為20 L/h，萃取時間60 min，萃取溫度為35、40、45、50、55 ℃條件下對精油得率的影響；設定CO2流量為20 L/h，萃取時間60 min，萃取溫度為40 ℃，萃取壓力為15、20、25、30、35 MPa 條件下對精油得率的影響；設定萃取壓力為25 MPa，萃取時間60 min，萃取溫度為40 ℃，CO2流量為10、15、20、25、30 L/h 條件下對精油得率的影響；設定萃取壓力為25 MPa，CO2流量為20 L/h，萃取溫度為40 ℃，萃取時間40、50、60、70、80 min 條件下對精油得率的影響。進行單因素試驗，分析萃取溫度、萃取壓力、CO2流量、萃取時間對精油得率的影響[15-17]。

1.2.3 印蒿精油成分分析

準確稱取印蒿精油0.20 g，用甲醇∶二氯甲烷（體積比為1 ∶4）混合溶液稀釋到10 mL，進樣前需要將樣品用0.45 μm 有機相濾膜過濾，直接進GC/MS 分析。色譜條件：RXi-5sil MS 石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（純度為99.99 %），流速：1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速率升溫至180 ℃；再以10 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，保持10 min。進樣口溫度：250 ℃，進樣量：1.0 μL，分流比：20 ∶1，溶劑延遲6 min。質譜條件：離子源：電轟擊電離（electron impact ion source，EI）源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；掃描范圍：40 m/z~450 m/z，質譜檢索圖庫：NIST 譜庫。

1.2.4 定性方法

移取正構烷烴C7～C30標準品，用正己烷將其稀釋成質量分數為5%溶液，按照1.2.3 儀器操作條件進樣，求出正構烷烴C7～C30保留時間，為下一步計算印蒿精油中各成分保留指數作準備。

根據Vanden Dool 和Kratz 的線性程序升溫的保留指數原理，利用自編軟件求得保留指數（kovats index，KI）值：

式中：tx為被分析組分；tn為碳原子數；tn+1為n 和n+1 的正構烷烴流出峰的保留時間，min。

樣品印蒿精油經過GC/MS 分析后，利用儀器自帶的NIST 質譜庫對印蒿精油中化學成分進行自動檢索，然后通過云南中煙技術中心開發的保留指數軟件求出各成分保留指數，將軟件計算的保留指數與精油數據庫中保留指數進行比對（可接受誤差不超過3%），對其進行定性。

2 結果與分析

2.1 印度印蒿單因素分析

2.1.1 萃取溫度

設定萃取壓力為25 MPa，CO2流量為20 L/h，萃取時間60 min，萃取溫度為35、40、45、50、55 ℃條件下，得出溫度對精油得率影響的折線圖，見圖1。

由圖1 可知，溫度在超臨界流體萃取中，溫度升高分子熱運動加快，溶劑揮發和擴散系數提高增加了分子間的締合幾率，使得萃取率提高。但另一方面溫度過高時，分子間的間距增大，密度減小，不利于傳質作用，并可能將易分解的物質分解從而降低萃取得率。

圖1 萃取溫度對萃取率的影響Fig.1 Influence of extraction temperature on extraction rate

2.1.2 萃取壓力

設定CO2流量為20 L/h，萃取時間60 min，萃取溫度為40 ℃，萃取壓力為15、20、25、30、35 MPa 條件下，得出萃取壓力對精油得率影響的折線圖見圖2。

圖2 萃取壓力對萃取率的影響Fig.2 Influence of extraction pressure on extraction rate

由圖2 可知，萃取壓力增大，萃取物的溶解度隨之增加，內部分子間的相互作用能急劇增大，使之更加接近油脂內部分子間的作用能。但當壓力過大時，CO2密度太大反而會降低傳質效率。

2.1.3 CO2流量

設定萃取壓力為25 MPa，萃取時間60 min，萃取溫度為40 ℃，CO2流量為10、15、20、25、30 L/h 條件下，得出CO2流量對精油得率影響的折線圖，見圖3。

圖3 CO2 流量對萃取率的影響Fig.3 Influence of CO2 flow rate on extraction rate

由圖3 可知，當CO2流量增大時，CO2與物料的接觸面積增大，提高了溶質密度和傳質速度。當流量過大時，物料與CO2接觸不夠充分，擴散速度不夠無法萃取到溶劑中，使得萃取效率降低。

2.1.4 萃取時間

設定萃取壓力為25 MPa，CO2流量為20 L/h，萃取溫度為40 ℃，萃取時間40、50、60、70、80 min 條件下得出萃取時間對精油得率影響的折線圖，見圖4。

圖4 萃取時間對萃取率的影響Fig.4 Influence of extraction time on extraction rate

由圖4 可知，隨著時間的增加，CO2與物料接觸時間更為充分，萃取效率增加，當達到一個時間點時，物料中的精油大部分被萃取出，往后的效率幾乎無變化。

2.2 正交試驗結果與分析

結合2.1 在單因素試驗基礎上，以印蒿精油得率作為評價指標，選取萃取溫度（45、50、55 ℃）、萃取壓力（25、30、35 MPa）、CO2流量（20、25、30 L/h）、萃取時間（50、60、70 min）進行四因素三水平正交試驗，優化印蒿精油提取工藝。正交試驗因素水平設計表如表1所示，結果如表2 所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal test factors

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal test design and results

由表2 可知，考察4 個重要因素指標，對試驗的影響大小排序為D＞C＞B＞A，最優組合為A2B2C3D2，既萃取溫度為50 ℃、萃取壓力30 MPa、CO2流量30 L/h、萃取時間60 min，在此條件下，通過多次試驗得出精油平均得率2.26%，得率優于正交試驗中的得率，因此最優組合為A2B2C3D2。并采用上述條件提取英國印蒿精油，得率為2.32%。

圖5 印度印蒿精油氣相色譜/質譜總離子流色譜圖Fig.5 GC/MS total ion flow chromatography of India Artemisia palls Wall.oil

2.3 印蒿精油成分分析

印蒿精油中成分經GC/MS 檢測所得到總離子流色譜圖見圖5~圖6，其結果采用Nist11 進行檢索后結合香精保留指數進行對比對其定性，利用面積歸一化法[18]計算得出印蒿精油中各成分相對百分含量，結果見表3。

通過質譜庫檢索，結合精油數據庫輔助定性，提高了天然化合物定性準確性，減少了誤判和錯判。對檢索出的化合物進行定性分析時，發現許多醇類、烷烯類等化合物，若僅用質譜庫檢索定性會難以判定甚至誤判，尤其是同系物和同分異構體的確定[19]。

圖6 英國印蒿精油氣相色譜/質譜總離子流色譜圖Fig.6 GC/MS total ion flow chromatography of English Artemisia palls Wall.oil

表3 印蒿精油成分分析Table 3 Composition analysis of Artemisia palls Wall.oil

續表3 印蒿精油成分分析Continue table 3 Composition analysis of Artemisia palls Wall.oil

通過質譜庫檢索和人工圖譜解析，結合保留指數比對，從印度印蒿精油中共鑒定出28 個化合物，占印蒿精油成分82.90%，其中烯烴類11 個，酯類5 個，醇類6 個，醚類1 個，酮類2 個，其它化合物3 個，主要成分包括：印蒿酮（36.585%）、大根香葉烯B（11.52%）、肉桂酸乙酯（6.45 %）、印蒿醚（5.46 %）、β-桉葉油醇（1.91%）、β-芹子烯（1.68%）、肉桂酸甲酯（1.30%）等化合物，其中酮類化合物含量最為豐富，占精油成分48.43%；從英國印蒿精油中共鑒定出40 個化合物，占印蒿精油成分83.80%，其中烯烴類16 個，酯類9 個，醇類7 個，醚類1 個，酮類2 個，醛類1 個，酚類1 個，其它化合物3 個，主要成分包括：印蒿酮（45.37%）、大根香葉烯B（11.78%）、肉桂酸乙酯（5.66%）、印蒿醚（4.27%）、β-芹子烯（2.52%）、肉桂酸甲酯（1.45%）、2，6，6-三甲基-1-亞甲基-2-環己烯（1.37%）等化合物，其中酮類化合物含量最為豐富，占精油成分45.45%。從本試驗結果可以看到，不同產地印蒿精油成分具有一定的相似性但各組分的相對百分含量具有較大的差異。

3 結論

采用超臨界萃取技術對印蒿油進行提取，并以精油得率為指標來優化萃取工藝條件，通過正交試驗得出超臨界最佳提取工藝條件；利用氣相色譜/質譜法，對提取印蒿精油成分進行分析，通過質譜庫檢索及保留指數驗證。從印度和英國印蒿精油中分別鑒定出28、40 種化合物，占總峰面積82.90%和83.80%，主要成分為：印蒿酮、大根香葉烯B、肉桂酸乙酯、印蒿醚等，在定性過程中，使用了保留指數進行驗證，提高了化合物定性準確性；本研究結果為印蒿精油開發應用提供了科學依據。