高效液相色譜-熒光法測(cè)定谷物及其制品中苯并（α）芘的不確定度評(píng)定

黃坤，郭嘉

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430075；2.武漢工程大學(xué)綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430205）

苯并（α）芘（benzo（α）pyrene，BaP）是一種含有5 個(gè)環(huán)的稠環(huán)芳烴化合物，由有機(jī)化合物在高溫條件下發(fā)生聚合反應(yīng)而產(chǎn)生，具有強(qiáng)烈的致癌、致畸、致突變作用[1-2]，因其污染引發(fā)的食源性疾病較為常見和廣泛[3]。工業(yè)三廢排放產(chǎn)生的苯并（α）芘通過空氣、水、土壤等進(jìn)入農(nóng)作物體內(nèi)進(jìn)行富集[4]，糧食烘干和晾曬過程也因與含有苯并（α）芘的煙道氣、瀝青路面接觸而受到污染[5]，作為日常生活的主要糧食消費(fèi)品谷物及其制品，也因此類生產(chǎn)過程和環(huán)境污染等原因面臨著苯并（α）芘的污染，因此在分析測(cè)試過程中有效評(píng)定苯并（α）芘測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量顯得尤為重要。我國(guó)GB 2715-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)糧食》中明確規(guī)定谷物及其制品中苯并（α）芘的含量不能超過5.0 μg/kg。目前關(guān)于各類食品檢測(cè)方法的不確定度評(píng)定不少[6-8]，但谷物及其制品中苯并（α）芘采用分子印跡柱凈化、熒光檢測(cè)的結(jié)果不確定度評(píng)定基本空缺。為了評(píng)估方法的不確定度，本文參考GB 5009.27-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并（α）芘的測(cè)定》，以小麥粉為例，對(duì)谷物及其制品中苯并（α）芘的測(cè)定不確定度進(jìn)行分析評(píng)定，找出影響結(jié)果的相關(guān)分量，在實(shí)際操作中可據(jù)此對(duì)相關(guān)環(huán)節(jié)進(jìn)行重點(diǎn)控制，從而提高提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，同時(shí)為其他產(chǎn)品中苯并（α）芘測(cè)定結(jié)果的不確定度評(píng)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

谷物及其制品（包括大米、小麥粉、玉米渣等）：產(chǎn)自湖北云夢(mèng)；乙腈、正己烷、二氯甲烷（色譜純）：美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.8%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.1.2 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（Waters e2695 Sep arations Module，2475 FLR Detector）：美國(guó)Waters 公司；Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：美國(guó)菲羅門公司；XS204 型精密天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Talboys 數(shù)顯型渦旋混合器：美國(guó)Troemner 公司；分子印跡固相萃取柱（500 mg，6 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理

準(zhǔn)確稱取已粉碎混勻的樣品1 g 左右（精確至0.000 1 g），置于15 mL 離心管中，加入10 mL 正己烷，渦旋混合0.5 min 使試樣完全分散，超聲提取10 min。高速離心后將上清液加入已活化好的分子印跡固相萃取柱，待液面降至柱床時(shí)，用6 mL 正己烷淋洗，棄去流出液。用6 mL 二氯甲烷分兩次洗脫并收集凈化液至離心管中，于40 ℃下氮吹至干，準(zhǔn)確移取1 mL 乙腈渦旋復(fù)溶0.5 min，過0.22 μm 微孔濾膜，續(xù)濾液供液相色譜分析。

1.2.2 色譜條件

Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為水，流速1.0 mL/min；等度洗脫：洗脫程序85%A，洗脫20 min；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)410 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取14.6 mg 苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.8%），用乙腈超聲溶解并定容至100 mL，即得濃度為144 μg/mL 的苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用1 mL 單標(biāo)線吸量管（A 級(jí)）吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL 于100 mL單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）中，用乙腈定容至刻度，混勻，即得濃度為1.44 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液；再用5 mL分度吸量管吸取標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液2.5 mL 于100 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）中，用乙腈定容至刻度，混勻，即得濃度為36.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

用1 mL 單標(biāo)線吸量管（A 級(jí)）吸取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（36.0 ng/mL）1 mL 于10 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得3.6 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用2 mL 單標(biāo)線吸量管（A 級(jí)）吸取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液2 mL 于10 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得7.2 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用5 mL分度吸量管（A 級(jí)）分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液3、4、5 mL于10 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，分別得到10.8、14.4、18.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用10 mL 分度吸量管（A 級(jí)）吸取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液8 mL 于10 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得28.8 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；直接將標(biāo)準(zhǔn)使用溶液作為36.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取以上7 種不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各進(jìn)樣2 次進(jìn)行液相色譜分析，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C 為橫坐標(biāo)、色譜峰面積Y 為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行擬合得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和線性回歸方程Y=A1C+A2（A1為斜率，A2為截距）。

1.2.4 重復(fù)測(cè)定與加標(biāo)回收試驗(yàn)

取同一陽性樣品，按1.2.1 下項(xiàng)方法、1.2.2 項(xiàng)下條件對(duì)苯并（α）芘的含量進(jìn)行6 次重復(fù)測(cè)定，取其平均值作為最終結(jié)果；取同一陰性樣品，按3.6 μg/kg 的水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定9 次，計(jì)算平均回收率。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

谷物及其制品中苯并（α）芘的含量計(jì)算公式如下：

式中：X 為谷物及其制品中苯并（α）芘的含量（重復(fù)測(cè)定6 次，取平均值作為最終結(jié)果），μg/kg；C 為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到的樣品溶液中苯并（α）芘的濃度，ng/mL；V 為樣品復(fù)溶的定容體積，mL；m 為樣品的稱樣質(zhì)量為回收率校正因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

從1.3 項(xiàng)下計(jì)算公式結(jié)合實(shí)際測(cè)定過程可知，苯并（α）芘測(cè)定結(jié)果不確定度urel（X）的主要來源包括：（1）樣品溶液濃度引入的不確定度urel（C）；（2）樣品最終定容引入的不確定度urel（V）；（3）樣品稱量引入的不確定度urel（m）；（4）測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度urel（x）；（5）測(cè)量回收率產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（R）。

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 樣品溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C）

樣品溶液濃度的不確定度來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度兩部分。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制包括儲(chǔ)備液的配制、儲(chǔ)備液的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備3 個(gè)過程。

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C1）

由1.2.3 項(xiàng)下的配制過程可知不確定度來源主要有以下3 個(gè)方面：

（a）標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C1a）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品證書可知，苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)品的純度誤差為±0.5%，按照均勻分布，則由純度引入的不確定度為：

（b）標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C1b）由2.2.3 項(xiàng)下處理可知由稱量引入的不確定度為：

（c）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C1c）按照J(rèn)JG 196-2006《常用玻璃量器》規(guī)定，20 ℃時(shí)100 mLA 級(jí)單標(biāo)容量瓶容量允差為±0.10 mL，按矩形分布計(jì)算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為參照2.2.2 項(xiàng)下處理，定容過程中100 mL 容量瓶由于環(huán)境溫度變化產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.158 20 mL。則標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C2）

根據(jù)1.2.3 項(xiàng)下的稀釋過程，按均勻分布處理，相關(guān)器具及溫度波動(dòng)引入的不確定度見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋過程引入的不確定度Table 1 Uncertainty resulting from dilution of standard stock solution

因此，由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C3）

由1.2.3 項(xiàng)下的制備過程可知由吸量管、容量瓶及溫度波動(dòng)引入的不確定度見表2。

因此，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備過程引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from preparation of standard curve

2.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C4）

根據(jù)1.2.3 項(xiàng)下的方法處理，測(cè)定數(shù)據(jù)及擬合結(jié)果如表3 所示。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線結(jié)果Table 3 Results of standard curve

取一陽性樣品重復(fù)測(cè)定6 次，將其峰面積代入線性回歸方程計(jì)算測(cè)定濃度，然后根據(jù)1.3 項(xiàng)下的公式計(jì)算含量，其測(cè)定結(jié)果見表3（測(cè)定液平均濃度C0為3.750 ng/mL）。則由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算公式如下為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率73 493；p 為對(duì)C0的測(cè)定次數(shù)，p=6；n 為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)試次數(shù)，本試驗(yàn)中7 個(gè)濃度各測(cè)定2 次為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的平均濃度，822。因此由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上所述，由樣品溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品最終定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）

樣品最終定容采用1 mL 移液器，其引入的不確定度來源于其校準(zhǔn)和環(huán)境溫度變化兩部分。按照校準(zhǔn)證書給出的擴(kuò)展不確定度U=0.04 μL（k=2），可知由校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度試驗(yàn)過程中雖有中央空調(diào)控溫，但由于各種原因環(huán)境溫度很難保證在20 ℃一成不變，設(shè)定室溫在（20±2）℃之間波動(dòng)。已知乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，按照矩形分布考慮則移液過程中由于環(huán)境溫度變化產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.001 58 mL。

綜上所述樣品最終定容1 mL 引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 樣品稱樣質(zhì)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）

樣品稱量的不確定度主要來源于稱量的重復(fù)性和天平校準(zhǔn)。天平校準(zhǔn)的不確定度與其靈敏度和線性相關(guān)，因稱量在較窄的范圍內(nèi)進(jìn)行，靈敏度可以忽略不計(jì)。

1）稱量重復(fù)性引入的不確定度u1（m）由天平的校準(zhǔn)證書得到擴(kuò)展不確定度U=0.32 mg（k=2），轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2）天平校準(zhǔn)引入的不確定度由天平的說明書得到其線性誤差為±0.000 5 g，服從矩形分布，轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

試驗(yàn)中樣品的平均稱樣量為1.002 7 g，因此由樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

按照1.2.4 項(xiàng)下的方法測(cè)定，重復(fù)性的試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of repeatability test

根據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》規(guī)定，試驗(yàn)結(jié)果為正態(tài)分布，采用極差法可知單次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差則標(biāo)準(zhǔn)不確定度因此由測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 測(cè)量回收率產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

按照1.2.4 項(xiàng)下的方法測(cè)定，回收率（R）的結(jié)果分別為92.14 %、90.51 %、96.03 %、93.85 %、94.71 %、93.68%、91.69%、93.55%、96.46% （平均回收率=93.62%），應(yīng)用貝塞爾公式可知單次測(cè)定回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差則標(biāo)準(zhǔn)不確定度因此由測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

為了確定回收率是否計(jì)入苯并（α）芘含量的計(jì)算中，對(duì)平均回收率與1.0 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)說明與1.0 具有高度顯著性差異，因此在計(jì)算公式中必須采用回收率校正因子對(duì)結(jié)果進(jìn)行修正。

2.3 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品溶液的濃度、定容體積、樣品稱樣量以及測(cè)量重復(fù)性等不確定度分量相互獨(dú)立，各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的數(shù)值及其貢獻(xiàn)見圖1，將上述不確定度進(jìn)行合成，得到合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，如下所示：

圖1 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量及其貢獻(xiàn)Fig.1 Relative standard uncertainty components and their contributions

2.4 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)JJF 1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》，取包含因子k=2（置信概率p≈95%）衡量，則擴(kuò)展不確定度為：

3 測(cè)量結(jié)果及其不確定度報(bào)告

用高效液相色譜-熒光法測(cè)定谷物及其制品中的苯并（α）芘，測(cè)定結(jié)果報(bào)告如下：

由測(cè)量結(jié)果可知依據(jù)GB 5009.27-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并（α）芘的測(cè)定》采用正己烷提取、分子印跡固相萃取凈化、高效液相色譜-熒光法測(cè)定谷物及其制品中苯并（α）芘的不確定度較小，測(cè)量結(jié)果具有較高的可信度和準(zhǔn)確度，能夠滿足日常檢測(cè)的質(zhì)量控制要求。

4 結(jié)論

試驗(yàn)過程中，稱量、定容、稀釋、儀器測(cè)定等操作過程都會(huì)引入不確定度，從本文不確定度的分析和計(jì)算過程可以發(fā)現(xiàn)，影響谷物及其制品中苯并（α）芘測(cè)定結(jié)果不確定度的因素主要為測(cè)量重復(fù)性、樣品溶液濃度和測(cè)量回收率，其次為樣品最終定容體積和樣品稱樣質(zhì)量。其中樣品溶液濃度因素中貢獻(xiàn)較大的分量是標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合和制備。因此在實(shí)際檢測(cè)過程中要嚴(yán)格控制溶液配制和測(cè)量操作，尤其要注意標(biāo)準(zhǔn)溶液相關(guān)操作過程的規(guī)范性和一致性，以及平行樣品的測(cè)定問題，定期對(duì)所涉儀器進(jìn)行檢定和提高實(shí)驗(yàn)人員的操作能力，以此減小測(cè)量不確定度，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。