響應曲面法優化鮮青花椒護色劑配方

蘆星淼，繆鋼，孫梅，朱毅

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；2.魯甸縣明德農業開發有限公司，云南昭通657000）

花椒（Zanthoxylum L.）可用于治療各種疾病，如高血壓、腹痛、腹瀉、頭痛、痢疾等，另外，也可用作滋補品、調味品和驅蟲劑[1]。研究表明，花椒提取液中含有酚類、黃酮類、萜類、蒽醌類和皂苷類化合物[2]，可抑制桃褐腐病菌，并可誘導桃果實產生抗性[3]，體內和體外試驗表明花椒和花椒葉提取物對Ⅱ型糖尿病及相關的并發癥有顯著的治療價值[2]；從花椒中分離中的活性成分可通過直接作用于血管平滑肌誘導血管舒張[1]；花椒精油對瘧原蟲、嗜人按蚊和中華按蚊具有殺蟲活性[4]，而且花椒精油對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠實驗性結腸炎具有保護作用[5]；花椒的莖可能是天然抗氧化劑和抗骨質疏松癥的良好來源[6]。

花椒根據顏色可分為青花椒和紅花椒，但是青花椒的品質優于紅花椒，青花椒中的麻味物質是紅花椒的1.6 倍，揮發油含量是紅花椒的2.4 倍[7]。鮮青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc）采摘后如果不及時處理極易發生褐變影響其經濟價值和品質[8-9]，但是目前關于花椒的研究主要集中在花椒提取物的成分及活性方面，青花椒護色方面的研究主要有張曉寧[10]等用響應曲面法，以色差為響應值，得到鮮青花椒的最佳護色工藝為：550 mg/L 的硫酸銅，1 000 mg/L 的抗壞血酸，殺菌時間20 min；張甫生等[11]采用微波和護色劑結合的處理方式制得干制青花椒，最佳的處理方式為：微波功率462 W，時間60 s，載料量50 g 對青花椒處理，之后再用含有30%乙醇和0.40%的異抗壞血酸鈉對花椒噴涂處理，室溫陰干，制得的花椒色澤青綠。關于鮮青花椒護色劑復配的研究較少，且使用的護色劑含有Cu2+，而人體攝入過多的Cu2+會對機體產生不良影響[12]，所以開發一種對青花椒護色效果較好且不含有Cu2+的護色劑配方是很必要的。

有研究表明光照和酶是影響青花椒干燥變色的主要因素[12]，其本質是葉綠素在各種因素的影響下發生反應，最終導致青花椒褐變，葉綠素在酸性的條件下不穩定，中性或者弱堿性的環境對葉綠素具有保護作用[13-14]，所以選擇碳酸鈉作為護色劑。Zn2+、Cu2+、Mg2+均可和葉綠素發生反應生成更穩定的化合物[15]，Cu2+對葉綠素的護色效果明顯[16]，但是Cu2+在體內積累會產生不良的影響，且硫酸銅不屬于食品添加劑，已被禁止添加于食品中，Mg2+的效果不如Zn2+，故選擇含有Zn2+的葡萄糖酸鋅作為護色劑，另外葡萄糖酸鋅還可以被用作營養補充劑[17]。抗壞血酸和檸檬酸是常用的抗氧化劑，可選擇抗壞血酸和檸檬酸作為護色劑。

所以本研究選取碳酸鈉、葡萄糖酸鋅、抗壞血酸和檸檬酸4 種護色劑，以開發一種安全有效的護色劑復配配方，延緩或降低鮮青花椒的褐變度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮青花椒：由魯甸縣明德農業開發有限公司提供，7 月中旬采摘置于保溫箱中4 ℃低溫避光運輸至實驗室后去掉枝葉，挑選顆粒完整、顏色均勻青綠、無褐變的新鮮青花椒，4 ℃冰箱保存備用。

葡萄糖酸鋅、抗壞血酸：北京奧博星生物科技有限責任公司；檸檬酸、碳酸鈉、丙酮：國藥集團化學試劑有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫干燥箱（HGZN-Ⅱ-270）：上海躍進醫療器械有限公司；紫外分光光度計（SP-2500）：上海光譜儀器有限公司；高速冷凍離心機（3H12RI）：湖南赫西儀器裝備有限公司；分析天平（ME204102）：梅特勒.托利多儀器（上海）有限公司；電子天平（DT500E）：常熟市佳衡天平儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 護色劑及濃度的選擇

單因素試驗護色劑濃度選擇見表1。

表1 單因素試驗護色劑濃度選擇Table 1 Concentration selection of color protective agent in single factor test

1.3.2 單因素試驗

稱取鮮青花椒10.0 g，浸泡于20 mL 不同濃度的上述護色劑中30 min，取出后平鋪于50 ℃鼓風干燥箱中30 min，以蒸發表面的水分并鈍化酶的活性；取出冷卻至室溫，置于塑料PE 自封袋中4 ℃冰箱避光保存，根據張曉寧等[10]對青花椒的處理，15 d 后測定鮮青花椒的褐變度和葉綠素含量。

1.3.3 Box-Beheken 試驗

根據單因素試驗結果，選取葡萄糖酸鋅（A）、檸檬酸（B）、抗壞血酸（C）3 個對花椒褐變度影響顯著的因素作為響應變量，變量的水平以-1、0、1 表示，以褐變度為響應值，利用軟件Box-Beheken 中心組合設計三因素三水平的響應面試驗。鮮青花椒護色劑配方優化的的Box-Beheken 試驗設計如表2 所示。

表2 Box-Beheken 試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Beheken test

1.4 指標測定

1.4.1 葉綠素含量測定

采用分光光度法，根據胡秉芬等[18]的方法稍作修改，稱取1.00 g 處理過的鮮青花椒樣品，加入2.0 mL 80%丙酮迅速研磨至提取完全，用80%丙酮沖洗并定容至15.0 mL，搖勻；4 ℃，10 000 r/min 離心20 min 后過濾，濾液分別在645 nm 和663 nm 下測定吸光度，根據下式計算葉綠素含量（mg/g）。

式中：A645、A633分別是鮮青花椒提取液在645 nm、663 nm 下的吸光度；V 為提取液體積，mL；m 為青花椒鮮重，g。

1.4.2 褐變度測定

根據消光值法[19]，稱取處理過的鮮青花椒1.00 g置于研缽中，加入2.0 mL 左右的蒸餾水迅速研磨，研磨充分后轉移至15 mL 離心管中，用蒸餾水洗滌研缽，洗滌液一并轉移至離心管中，定容至10 mL。于4 ℃，10 000 r/min 下離心20 min，過濾后取上清液在410 nm處測定其吸光值A410，褐變度以10×A410表示。

1.5 數據分析

單因素試驗數據使用Excel 2010 處理，制作圖表，進行單因素方差分析；Box-Beheken 試驗數據用軟件Design-Expert 8.0.6 分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同濃度護色劑處理對花椒褐變度的影響

探究不同濃度的抗壞血酸、檸檬酸、碳酸鈉、葡萄糖酸鋅對鮮青花椒褐變度的影響，結果如圖1 所示。

由圖1A 可知，隨著抗壞血酸濃度的增加，鮮青花椒的褐變度呈現先降低再升高的趨勢，當濃度達到0.60%后，不同濃度的抗壞血酸處理結果之間不顯著，當濃度為0.80%時褐變度最低，與對照組相比褐變度降低56.44%；由圖1B 可知，用不同濃度的檸檬酸處理鮮青花椒，鮮青花椒的褐變度隨檸檬酸濃度的升高先降低再升高，低濃度的檸檬酸就會對鮮青花椒的褐變度產生顯著性影響，褐變度最低時對應的檸檬酸濃度為0.50 %，此濃度處理可使鮮青花椒的褐變度降低50.68%；由圖1C 可知，鮮青花椒的褐變度隨碳酸鈉濃度的升高先降低后升高，最佳的使用濃度為0.70%，在該濃度下，鮮青花椒的褐變度與對照組相比降低31.96 %；從圖1D 可以看出，不同濃度的葡萄糖酸鋅處理會影響鮮青花椒的褐變度，當濃度為0.07 %時，鮮青花椒的褐變度最低為9.46，與對照組相比降低31.89%。

對試驗結果進行單因素顯著性差異分析，研究不同護色劑對鮮青花椒褐變度的影響顯著程度，結果表明：抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅對鮮青花椒褐變度的影響均達到顯著水平（P＜0.05），碳酸鈉對鮮青花椒褐變度的影響未達到顯著性水平（P＞0.05）。故以褐變度為指標可選擇抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅這3 種護色劑進行響應面試驗設計。

2.1.2 不同濃度護色劑處理對鮮青花椒葉綠素含量的影響

采用分光光度法測定不同濃度的抗壞血酸、檸檬酸、碳酸鈉、葡萄糖酸鋅處理后的鮮青花椒的葉綠素含量，結果如圖2 所示。

圖2A 表明，鮮青花椒的總葉綠素含量隨抗壞血酸濃度的增加先迅速升高，后升高速度變慢；在抗壞血酸的濃度為0.60%時，總葉綠素含量達到最大值0.26 mg/g，與對照組相比高44.44%；隨后總葉綠素含量隨抗壞血酸濃度的增加呈下降趨勢；葉綠素a 含量和葉綠素b 含量隨抗壞血酸濃度的變化趨勢與總葉綠素含量基本相同。由圖2B 可知，在檸檬酸的濃度小于0.30%時，鮮青花椒中的總葉綠素含量與檸檬酸的濃度呈正相關；在濃度為0.30%時，總葉綠素含量達到最大值0.21 mg/g，與對照組相比高16.67%；隨后總葉綠素含量隨檸檬酸濃度的增加呈緩慢下降趨勢。圖2C表明，鮮青花椒中的總葉綠素含量隨碳酸鈉濃度的增加呈先緩慢升高后緩慢下降的趨勢，在碳酸鈉的濃度為0.50 %時，鮮青花椒中的總葉綠素含量最高為0.23 mg/g，比對照組高27.78%，可能原因是葉綠素在酸性條件下不穩定，弱堿性的條件對葉綠素具有保護作用，隨著碳酸鈉濃度的增加，溶液的pH 值升高，從而失去對葉綠素的保護作用。圖2D 結果顯示，在葡萄糖酸鋅的濃度低于0.07%時，鮮青花椒的總葉綠素含量隨葡萄糖酸鋅濃度的升高不斷增加；葡萄糖酸鋅的濃度為0.07%時總葉綠素含量最高；隨后總葉綠素含量呈下降趨勢。

圖2 不同濃度護色劑處理對鮮青花椒葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of different concentration of Colour preservatives on chlorophyll content of Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc

在圖2 中，鮮青花椒中的葉綠素a 含量、葉綠素b含量與總葉綠素含量的變化趨勢基本相同。對不同濃度的護色劑處理后，鮮青花椒的總葉綠素含量進行單因素顯著性差異分析，結果表明，抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅對鮮青花椒中的總葉綠素含量的影響顯著（P＜0.05），而碳酸鈉對鮮青花椒的總葉綠素含量影響未達到顯著水平（P＞0.05）。當以總葉綠素含量為檢測指標時，可選擇抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅這3 種護色劑設計響應面試驗。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果，選擇葡萄糖酸鋅（A）、檸檬酸（B）、抗壞血酸（C）這3 個對鮮青花椒的褐變度和綠葉素含量影響顯著的護色劑作為自變量，以褐變度為響應值（Y），利用Design-Expert 8.0.6 軟件設計三因素三水平的響應面試驗，響應面的試驗設計和結果如表3 所示。

表3 響應面試驗設計和結果Table 3 Response surface test design and results

續表3 響應面試驗設計和結果Continue table 3 Response surface test design and results

2.2.2 模型與方差分析

用Design-Expert8.0.6 軟件對試驗數據方差分析，結果如表4 所示。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance table

得到的各因素與響應值間的回歸模型方程為：。模型的P 值為0.040 6，說明建立的回歸模型顯著；所建立回歸模型的決定系數R2為0.837 1，說明鮮青花椒褐變度的實測值與預測值擬合較好，可用此模型來預測不同濃度的葡萄糖酸鋅、檸檬酸、抗壞血酸對鮮青花椒褐變度的影響；模型中二次項C2對響應值的影響極顯著（P＜0.01），而其他的項對響應值的影響并未達到顯著水平，說明不同濃度的護色劑之間可能存在相互作用，并非單一的線性關系；各因素對響應值的影響可通過方差分析中的F 值評價，F 值越大，說明對響應值的影響越顯著[20]，所以各護色劑對鮮青花椒褐變度的影響順序為：檸檬酸＞葡萄糖酸鋅＞抗壞血酸。

2.2.3 響應面分析

采用Design-Expert8.0.6 軟件對試驗結果進行多元回歸分析，得到護色劑葡萄糖酸鋅（A）、檸檬酸（B）、抗壞血酸（C）對鮮青花椒褐變度交互影響的響應面，如圖3 所示。

圖3 兩因素交互影響鮮青花椒褐變度的等高線及響應面圖Fig.3 Effect of two factors on browning degree of Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc：contour line and response surface diagram

等高線是響應面水平方向的投影，反應的是各因素之間是否存在交互作用，等高線形狀呈橢圓表示兩因素對響應值的交互作用顯著，等高線形狀呈圓形則表示兩因素對響應值的交互作用不顯著[20]。圖3b 中的響應面結果顯示A 軸方向的坡度較B 軸平緩，說明檸檬酸對鮮青花椒褐變度的影響較葡萄糖酸鋅大；圖3d中的響應面果顯示C 軸的坡度較A 軸平緩，說明葡萄糖酸鋅對鮮青花椒褐變度的影響較抗壞血酸大；圖3f中的響應面結果說明：與抗壞血酸相比，檸檬酸對鮮青花椒褐變度的影響更大。這個結果與方差分析的結果一致：護色劑對鮮青花椒褐變度的影響兩兩之間存在交互作用；各護色劑對鮮青花椒褐變度的影響順序為：檸檬酸＞葡萄糖酸鋅＞抗壞血酸。

經分析可知，使鮮青花椒褐變度最低的護色劑配方為：葡萄糖酸鋅0.07 %，檸檬酸0.46 %，抗壞血酸0.69%，在此護色劑條件下，鮮青花椒的褐變度為5.88。

3 結論

單因素試驗得到對鮮青花椒褐變度影響較大的3 種護色劑是抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅。響應面試驗優化鮮青花椒的護色劑配方，得出3 種護色劑對鮮青花椒褐變度的影響順序為：檸檬酸＞葡萄糖酸鋅＞抗壞血酸；得到的最優護色劑配方為：葡萄糖酸鋅0.07%，檸檬酸0.46%，抗壞血酸0.69%，在此護色劑條件下，鮮青花椒的褐變度為5.88，與放置相同時間不用護色劑處理的鮮青花椒相比降低6.00 左右，說明使用此護色劑配方可明顯降低或延緩鮮青花椒的褐變度。此方法雖然可以有效的降低鮮青花椒的褐變，但是Cu2+在機體積累會產生毒害作用，另外GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中并未將硫酸銅規定為食品添加劑，而本研究得到的添加劑配方不含有硫酸銅，含有的抗壞血酸、葡萄糖酸鋅一方面可以起到降低鮮青花椒褐變度的作用，另一方面也可作為營養補充劑，配方中的檸檬酸作為一種酸度調節劑，同時還有抗氧化的作用[21]，廣泛用于各類食品中，和抗壞血酸具有協同作用。所以本研究得到的護色劑配方既可以顯著降低鮮青花椒的褐變度，同時具有安全、易得、經濟的特點，可為鮮青花椒的護色提供理論依據。