MdCYP707A1 異位表達擬南芥參與非生物脅迫和ABA 應答

張婷婷,康 慧,付璐璐,由春香,王小非,郝玉金

作物生物學國家重點實驗室；山東果蔬優質高效生產協同創新中心/山東農業大學園藝科學與工程學院,山東 泰安271018

干旱、鹽、滲透等環境脅迫是制約植物生長的主要非生物脅迫[1]，脅迫條件下會誘導ABA 的積累[2-4]。ABA 是植物體內最關鍵的調節因子之一，它可以調控植物的生長發育，提高植物對生物和非生物脅迫的抗性[5-7]。在高等植物中，存在兩種信號途徑調控植物對外界脅迫的應答，即ABA 依賴和ABA 非依賴的方式[1]。除了ABA 信號途徑調控植物的抗性外，ABA 的生物合成和降解途徑也參與植物抗性的調控[8-10]。有研究表明，干旱、低溫、高鹽都可以通過啟動與ABA 相關的途徑提高植物對環境脅迫的抗性[11]，例如，在擬南芥中，ABF3 可以結合在ABA 轉導關鍵基因ABI5 的啟動子上，激活ABI5 的表達，提高植物體內ABA 的含量，進而提高對鹽脅迫的抗性[12]；擬南芥NGATHA1轉錄因子在脫水脅迫下通過激活NCED3基因誘導ABA 生物合成，提高植物對干旱的抗性[13]。因此，ABA 合成途徑對于植物對外界環境的抵抗作用是十分重要的。

鎘作為一種重金屬，不僅會造成環境污染，還威脅到人類的健康[14]。植物吸收鎘主要是通過根系[15]，過量鎘的攝入會抑制植物的生長發育，甚至導致植物死亡[16]。鎘脅迫是一種典型的氧化脅迫，會破壞植物體內的抗氧化系統[17]，遭遇鎘毒害的植物，葉面和葉邊緣會有黃色枯死細胞、莖桿變黃，甚至枯死[18]。植物進化出了很多抗鎘脅迫的機制，如抑制鎘離子的吸收和轉運、改變根際pH、與根部微生物產生效應等[16]，其中，植物最主要的抗鎘脅迫的調控機制是抗氧化系統，主要包括抗壞血酸、還原型谷胱甘肽等非酶抗氧化保護物和超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化保護酶類[19]，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等[20]。當植物遭受鎘脅迫等氧化脅迫時，其體內的抗氧化酶類的活性和編碼基因的表達都顯著提高，從而增強植物的抗性[20-25]。

CYP707A 家族成員編碼8′-羥化酶，參與ABA 的氧化分解[5,26-29]，它們主要在種子中表達，參與種子休眠和萌發的調控[30-32]，此外，過表達CYP707A1也可以降低植物對非生物脅迫的抗性[31]。實驗前期對MdCYP707A1的研究發現，MdCYP707A1可以參與調控種子休眠、萌發、非生物脅迫[33]，本研究將MdCYP707A1在擬南芥中異源表達，進一步對其在非生物脅迫中的功能進行分析，旨在進一步揭示木本植物中ABA 合成途徑調控逆境響應的機理，為完善ABA 信號途徑的調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長條件

本研究中所用的擬南芥野生型為哥倫比亞生態型（Col-0），培養擬南芥所用的培養基為MS 培養基[1/2MS+10 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂（pH 5.7）]，抗性培養基的配制是在MS 培養基的基礎上加入相應濃度的ABA、PEG、NaCl 和CdCl2，用光照培養箱進行培養，條件為長日照（16 h 光照/8 h黑暗），溫度為19～22 ℃。

1.2 RNA 的提取和熒光定量PCR

RNA 的提取采用試劑盒法，所用試劑盒為RNA plant plus Reagent 試劑盒（天根），反轉錄試劑盒為PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time，TaKaRa），反轉錄后的cDNA為熒光定量的模板。熒光定量PCR 以18S RNA為內參基因，UltraSYBR Mixture（with ROX）為熒光定量的染料，PCR 所用的反應體系如下：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上游引物（10 mmol·L-1）1.0 μL，下游引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，共20 μL。每個模板3 次生物學重復。熒光定量PCR 反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，65 ℃延伸10 s，40 次循環。最后采用2-ΔΔCT法進行定量數據分析。PCR 所用引物在表1 中列出。

表1 基因克隆和定量PCR 所用引物Table 1 Primers used for gene cloning and quantitative PCR

1.3 擬南芥的遺傳轉化

本研究中所用的擬南芥遺傳轉化的方法參照Clough&Bent（1998）[34]的方法。擬南芥的遺傳轉化采用花序侵染的方法。將構建好的MdCYP707A1-PRI101載體[33]轉化農桿菌4404 菌株，篩選陽性克隆，所用抗性板為300 mg·L-1利福平和30 mg·L-1卡那霉素。將陽性克隆的農桿菌在LB 液體培養基中28 ℃培養過夜，用侵染液懸浮使其OD 值為0.6～0.8，剪掉果夾，將剛剛展開的花苞浸入侵染液中15 S 左右，暗處理16 h 以上，放到長日照下正常生長。每隔1 周侵染1 次，連續侵染3 次。

將獲得T0代擬南芥種子28 ℃烘干，進行無菌消毒處理。消毒所用試劑為70%的無水乙醇，消毒5 min，無菌水清洗一次，2%次氯酸鈉溶液，消毒8 min，用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，清洗5～7 遍后，用牙簽將其點鋪在含有60 mg·L-1卡那霉素的1/2 MS 固體培養基上，低溫暗處理2～3 d，放到光照培養箱中生長10～15 d，將子葉保持綠色的幼苗轉移到基質中，提取RNA 進行定量鑒定，收取表達量較高的種子進行逐代篩選，用純合的T3代種子進行抗性實驗研究。

1.4 擬南芥表型分析和生理指標的檢測

根長的統計采用Image J 圖片分析軟件，將圖像導入Image J 軟件中，自定義比例尺等要素，獲得根的實際長度。

擬南芥鮮質重獲取：在天平上稱取新鮮擬南芥幼苗，重復3 次，取平均值作為最終實驗結果。

擬南芥葉綠素的檢測采用丙酮法[35]，將擬南芥葉片浸泡在80%的丙酮中過夜，直至葉綠素完全提取，檢測663 nm 和645 nm 波長下的吸光值，并用以下公式計算葉綠素的含量：Ca十b＝20.3×A645-8.04×A663。

1.5 GUS 染色和顯微鏡拍照

GUS 染色液的成分為0.5 mM K3[Fe(CN)6],0.5 mM K4[Fe(CN)6]·H2O,100 mM NaH2PO4·2H2O,100 mM Na2HPO4·12H2O,10 mM EDTA·Na2·2H2O,1 mM X-gluc。將各個時期的擬南芥組織取材，浸入侵染液，37 ℃染色3～5 h，在解剖顯微鏡下成像。實驗重復3 次，n≥10。

1.6 過表達擬南芥的表型分析

消毒處理的擬南芥種子（Col-0，OX-2，OX-4，OX-6，）在MS 培養基上培養4 d，將長勢一致的幼苗分別移到MS，MS+5 μmol·L-1ABA 和MS+10 μmol·L-1ABA、MS+3%PEG6000、MS+100 mM·L-1NaCl、MS+100 μmol·L-1CdCl2、MS+150 μmol·L-1CdCl2培養基上，放在相同生長條件下培養14 d 左右，進行表型觀察和拍照。

1.7 過表達擬南芥的表型分析

以上所有試驗結果為至少3 次生物學重復。作圖采用GraphPad Prism 7 軟件，數據分析采用Data Processing System（DPS 7.55）軟件，顯著性差異分析采用Tukey 方法。

2 結果與分析

2.1 MdCYP707A1 調控ABA 代謝

為了驗證MdCYP707A1的功能，我們克隆了蘋果中的MdCYP707A1[33]，并將其在擬南芥中異源表達，qRT-PCR 結果表明，轉基因擬南芥中MdCYP707A1的表達量顯著上調（圖1），證明MdCYP707A1確實轉入了擬南芥。此外，我們檢測了MdCYP707A1過表達擬南芥中與ABA 合成相關的基因AtABI5和AtNCED3的表達，發現它們的表達量顯著下調（圖1），說明MdCYP707A1的過表達抑制了ABA合成相關基因的表達，進而抑制了ABA 的合成，與在愈傷中過表達MdCYP707A1的結果一致[33]。

圖1 蘋果MdCYP707A1 與擬南芥AtABI5 和AtNCED3 的表達分析Fig.1 Expression analysis of MdCYP707A1 in apple and AtABI5 and AtNCED3 in Arabidopsis thaliana

2.2 MdCYP707A1 在不同組織中的表達模式

已經有數據表明，MdCYP707A 基因家族在蘋果的各個組織中都有表達，且在種子中表達量較高[33]。為了進一步驗證MdCYP707A1的組織表達模式，我們將proMdCYP707A1-GUS轉入擬南芥中，分別檢測了1 d 幼苗、3 d 幼苗、5 d 幼苗、7 d 幼苗、14 d 幼苗，5 周的葉子、花后的葉子，莖生葉和莖、根、莖、花和果莢的GUS 染色情況，發現剛萌發的幼苗（圖2，A）染色較深，說明MdCYP707A1參與種子萌發時的調控；在第3 天的幼苗中，子葉和下胚軸染色較深（圖2，B）；而在第5、7、14天的幼苗中，GUS 活性主要在下胚軸中檢測到，而在根中表達較弱（圖2，C,D,E）；而在成熟的組織中，果莢中的GUS 活性較高（圖2，F-L）。以上結果說明，MdCYP707A1主要在ABA 種子萌發與成熟中發揮功能，間接說明MdCYP707A1可能參與種子休眠等生理過程的調控。

圖2 GUS 染色檢測MdCYP707A1 在擬南芥各個組織中的表達Fig.2 GUS staining for detection of MdCYP707A1 expression in Arabidopsis thaliana tissues

2.3 過表達MdCYP707A1 對ABA 不敏感

鑒于MdCYP707A1是參與ABA 分解代謝的關鍵基因，我們檢測了過表達MdCYP707A1擬南芥對ABA 的抗性。分別將萌發后4 d 的幼苗轉移到MS、MS+5 μmol·L-1ABA 和MS+10 μmol·L-1ABA的培養基上，在長日照（16 光照/8 黑暗）下培養14 d 觀察表型，結果表明，在MS 培養基上，野生型（Col-0）和過表達MdCYP707A1（OX-2，OX-4，OX-6）的擬南芥長勢無明顯差異，而在含有ABA的培養基上，過表達擬南芥長勢顯著好于野生型（圖3），說明過表達MdCYP707A1對ABA 不敏感。

圖3 擬南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 轉基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗在ABA 處理下14 d 時的生長狀態Fig.3 The seedlings of the wild type(Col-0)and MdCYP707A1 transgenic lines(OX-2,OX-4,OX-6)of Arabidopsis thaliana were treated with ABA for 14 days

ABA 處理后，過表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）根長、鮮重和葉綠素的含量都顯著高于野生型（Col-0）（圖4），說明過表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）提高對ABA 的抗性，即對ABA 敏感性降低。

圖4 擬南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 轉基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗經ABA 處理后14 d 的根長、鮮重和葉綠素含量Fig.4 Wild type(Col-0),MdCYP707A1 overexpression(OX-2,OX-4,OX-6)were treated with ABA for 20 days and determination of root length,fresh weight and chlorophyll content

2.4 MdCYP707A1 參與到不同的非生物抗性

非生物脅迫可以誘導ABA 的積累從而增強植物的抗性[5-7]，并且基于MdCYP707A1的轉基因蘋果愈傷組織對NaCl、PEG 和甘露醇的抗性降低[33]，因此，我們在擬南芥中檢測過表達MdCYP707A1是否具有相同的功能。將在正常MS 培養基上培養4 d 的幼苗轉移到MS、MS+3%PEG6000、MS+100 mM·L-1NaCl 的培養基上，在長日照條件下培養14 d 后觀察表型。過表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）在加入PEG 和NaCl 的培養基上的長勢顯著弱于野生型（Col-0）（圖5），說明過表達MdCYP707A1降低了對非生物脅迫（PEG 和NaCl）的抗性。

圖5 擬南芥野生型（Col-0）MdCYP707A1 轉基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗在PEG 和NaCl 處理下14 d 時的生長狀態Fig.5 The seedlings of the wild type(Col-0)and MdCYP707A1 transgenic lines(OX-2,OX-4,OX-6)of Arabidopsis thaliana were treated with PEG and NaCl for 14 days

PEG 和NaCl 處理后，過表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）根長、鮮重和葉綠素的含量都顯著低于野生型（Col-0）（圖6），說明表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）降低對PEG 和NaCl 的抗性。

圖6 擬南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 轉基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗經PEG 和NaCl 處理后14 d 的根長、鮮重和葉綠素含量Fig.6 Wild type(Col-0),MdCYP707A1 overexpression(OX-2,OX-4,OX-6)were treated with PEG and NaCl for 20 days and determination of root length,fresh weight and chlorophyll content

2.5 過表達MdCYP707A1 提高對鎘脅迫的抗性

有研究表明，ABA 信號可以參與植物對鎘脅迫的抗性[50,51]，因此我們想檢測MdCYP707A1的過表達是否會影響擬南芥對鎘的抗性。我們將MS培養基上生長4 d 的幼苗轉移到MS、MS+100 μmol·L-1CdCl2、MS+150 μmol·L-1CdCl2的培養基上，在長日照條件下培養14 d 后，我們發現過表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）在加入CdCl2的培養基上的長勢顯著好于野生型（Col-0）（圖7），說明過表達MdCYP707A1提高了對鎘脅迫的抗性。

圖7 擬南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 轉基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗在CdCl2處理下14 d 時的生長狀態Fig.7 The seedlings of the wild type(Col-0)and MdCYP707A1 transgenic lines(OX-2,OX-4,OX-6)of Arabidopsis thaliana were treated with CdCl2for 14 days

CdCl2處理后，過表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）根長、鮮重和葉綠素的含量都顯著高于野生型（Col-0）（圖6），說明表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）提高對CdCl2的抗性。

圖8 擬南芥野生型（Col-0）、MdCYP707A1 轉基因株系（OX-2、OX-4、OX-6）幼苗經CdCl2處理后14 d 的根長、鮮重和葉綠素含量Fig.8 Wild type(Col-0),MdCYP707A1 overexpression(OX-2,OX-4,OX-6)were treated with CdCl2for 20 days and determination of root length,fresh weight and chlorophyll content

2.6 過表達MdCYP707A1提高擬南芥中谷胱甘肽還原酶(AtGR1)和超氧化物歧化酶(AtFeSOD)基因的表達

鎘脅迫會引起植株氧化脅迫的傷害，進而使植物的抗氧化系統產生變化，尤其是抗氧化酶的變化[17]，因此，我們檢測了鎘處理后，野生型（Col-0）和過表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）中谷胱甘肽還原酶（AtGR1）和超氧化物歧化酶（AtFeSOD）的表達，發現鎘處理后，過表達擬南芥（OX-2，OX-4，OX-6）中AtGR1和AtFeSOD的表達量顯著上調，說明過表達MdCYP707A1提高了抗氧化酶相關基因的表達，進而提高了對鎘脅迫的抗性（圖9）。

圖9 鎘處理后谷胱甘肽還原酶（AtGR1）和超氧化物歧化酶（AtFeSOD）的表達分析Fig.9 Expression analysis of glutathione reductase(AtGR1)and superoxide dismutase(AtFeSOD)after CdCl2treatment

3 討論

ABA 的生物合成和分解途徑既是相互獨立又是相互影響的[36]，轉基因材料的過表達實驗表明，NCED 是ABA 合成中的限速酶[36,37]，而8′-羥化酶是ABA 氧化失活過程中的關鍵酶[28,39]，植物體內ABA 穩態的調控是一個復雜的網絡，ABA 的動態平衡涉及到許多酶和轉運蛋白的共同調控，越來越多的證據表明，ABA 的產生或失活相關基因的調控在ABA 穩態中發揮重要作用[39]。在先前的研究中，過表達MdCYP707A1愈傷組織，降低了ABA 合成基因ABI5和NCED3的表達[33]，本研究中，在擬南芥中過表達MdCYP707A1也降低了ABI5和NCED3的表達（圖1），說明ABA 合成和分解途徑是相互影響的，這可能與植物體內ABA 穩態的調控有關。

ABA 雖然是植物生長的抑制因子[41]，但是過表達降解ABA 的CYP707A 家族成員會抑制植株生長，例如，過表達番茄SlCYP707A1和桃PpeCYP707A1表現出植株矮小、葉面積減小的表型[42,43]，但是過表達桃PpeCYP707A1促進種子萌發，減少ABA 處理條件下葉片的黃化，對ABA 不敏感[42]，此外，過表達蘋果MdCYP707A1愈傷組織降低對NaCl、PEG 和甘露醇的抗性，提高擬南芥種子的萌發率[33]。本研究對MdCYP707A1過表達擬南芥的幼苗進行了抗性研究。MdCYP707A1的過表達擬南芥在加入5 μmol·L-1ABA 和10 μmol·L-1ABA 的培養基上的長勢明顯好于野生型（圖3），根長、鮮重、葉綠素等生理指標也顯著高于野生型（圖4），說明過表達MdCYP707A1對ABA 不敏感，與先前的研究一致。而在PEG 和NaCl 的培養基上，過表達MdCYP707A1長勢顯著低于野生型（圖5），生理指標的檢測與表型一致（圖6），說明過表達MdCYP707A1擬南芥降低了對非生物脅迫的抗性。

鎘脅迫是一種重金屬脅迫，高濃度的鎘會對植物產生毒害作用[44-46]，鎘脅迫條件下，會誘導ABA的生物合成，提高小麥[47]、大麥[48]幼苗對鎘的耐受性，降低蕓薹屬植物[49]和水稻[50,51]幼苗莖中鎘的含量。外源ABA 會誘導植物體內鎘含量增加，提高植物對鎘脅迫的抗性[52]；另有研究表明，水稻體內的植物螯合蛋白合成酶2(OsPCS2)通過降低鎘在水稻中的積累而提高了鎘的耐受性[53]，因此，植物體內鎘含量的高低不是判斷植物耐受性的標準。有趣的是，本研究中發現，過表達ABA 分解代謝中的關鍵酶MdCYP707A1降低了對干旱、NaCl 等滲透脅迫的抗性，反而提高了對鎘等氧化脅迫的抗性，過表達（OX-2，OX-4，OX-6）植株體內谷胱甘肽還原酶(AtGR1)和超氧化物歧化酶(AtFeSOD)的表達量也是上調的，說明過表達MdCYP707A1確實可以提高對鎘脅迫的抗性。我們推測，ABA 在介導植物抗性方面發揮不同的作用，或者有其他機制參與到植物抗性的調控過程中，其中的機理還有待進一步解析。

蘋果產業是一種有前景的果樹產業，生產中蘋果產業的發展受干旱、鹽漬、重金屬等外界環境的制約。本研究從ABA 合成和降解的角度出發，解析了MdCYP707A1基因在干旱、鹽脅迫、鎘脅迫中的部分功能，為進一步完善ABA 信號和生物合成的機理研究奠定了一定的基礎。