Skp2 高表達(dá)與骨肉瘤患者新輔助化療耐藥之間的聯(lián)系

許多輝 丁 路 余 偉 宋正南 白靖平

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院骨軟科，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院骨一科，新疆烏魯木齊 830000

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是好發(fā)于兒童和青少年的骨惡性腫瘤[1-2]。新輔助化療使骨肉瘤5 年生存率大幅度提高[3-4]，近幾十年5 年生存率進(jìn)入了平臺期，化療耐藥是主要因素之一[5-6]。因此，探索骨肉瘤化療耐藥的分子機(jī)制，是改善預(yù)后的關(guān)鍵。

S 期激酶相關(guān)蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）可識別和降解細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑（CKI），如p21、p27 等[7]。前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[8-10]，Skp2 可抑制細(xì)胞凋亡，增加侵襲能力，促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），敲除Skp2 可逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）特征。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫和骨肉瘤樣本探討Skp2 在患者中的表達(dá)。

1 對象與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和分析

GSE126209 含6 例骨肉瘤樣本和5 例癌旁組織。GSE16089 含甲氨蝶呤敏感的Saos-2 骨肉瘤細(xì)胞和甲氨蝶呤耐藥的Saos-2 細(xì)胞各3 株。TCGA 數(shù)據(jù)含87 例附生存信息的骨肉瘤樣本。

limma 軟件包計(jì)算GSE126209 和GSE16089 中的差異表達(dá)基因（DEGs）。篩選條件為logFC＞1 且P ＜0.05。clusterProfiler 軟件包對DEGs 進(jìn)行富集分析，篩選閾值P ＜0.05。

1.2 研究對象

收集2018 年2 月—2019 年6 月新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（以下簡稱“我院”）骨軟科按標(biāo)準(zhǔn)方案收治的OS 患者所有患者均采用新輔助化療方案：甲氨喋呤：8～12 g/m2、阿霉素：60～90 mg/m2、順鉑：120～150 mg/m2、異環(huán)磷酰胺15 g/m2。共2 個(gè)循環(huán)（10 d）。經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批及患者、家屬同意后獲取腫瘤及癌旁組織各17 例。見表1。按腫瘤細(xì)胞壞死率（TCNR）≥90%為非耐藥，TCNR＜90%為耐藥分組[11]：非耐藥腫瘤組織（A 組）11 例和耐藥腫瘤組織（B 組）6 例；非耐藥癌旁組織（C 組）11 例和耐藥癌旁組織（D組）6 例。

表1 耐藥與非耐藥患者一般資料比較

1.3 腫瘤細(xì)胞壞死率的測定

沿最大徑做縱切面后分區(qū)。每個(gè)分區(qū)按上、中、下取材、制片后鏡檢。見圖1。

圖1 標(biāo)本取材

1.4 RT-qPCR

Trizol（Ambion，15596-026）提取樣本RNA，HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）（VAZYME，R101-01/02）反轉(zhuǎn)錄。SYBR Green Master Mix（VAZYME，Q111-02）獲得RT-PCR 產(chǎn)物。結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參基因進(jìn)行2-△△Ct分析。

1.5 Western-blot

單去污劑裂解（含PMSF）樣本，BCA 試劑盒（Solarbio）測上清蛋白濃度。WB 檢測Skp2（Ab183039）、AKT（Ab18785）、p21（Ab109520）、p27（Ab32034）、FOXO1（Ab52857）、E-cadherin（Ab40772）蛋白表達(dá)。分別計(jì)算與GAPDH（Bioswamp，PAB36269）的灰度比值（%）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用Fisher確切概率法。骨肉瘤預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素采用Cox 回歸分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Skp2 與OS 耐藥相關(guān)

Skp2 在OS 和耐藥腫瘤中均上調(diào)（P ＜0.05）（圖2A、2B）。富集分析示Skp2 在耐藥腫瘤中參與細(xì)胞周期和FOXO 通路等（圖2C）。String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）示Skp2 與AKT，F(xiàn)OXO 通路和細(xì)胞凋亡基因間具有互作關(guān)系（圖2D）。

2.2 mRNA 表達(dá)差異

圖2 Skp2 與耐藥相關(guān)

RT-qPCR 結(jié)果示，與A 組比較，B 組Skp2 和AKT顯著上調(diào)，p27、FOXO1、E-cadherin 顯著下調(diào)，C 組Skp2、AKT、E-cadherin 顯著下調(diào)，P21、P27、FOXO1 顯著上調(diào)（P ＜0.05）；與B 組比較，D 組Skp2、p21、AKT 下調(diào)，p27、FOXO1、E-cadherin 顯著上調(diào)。見圖3。

圖3 Skp2、AKT、p21、p27、FOXO1、E-cadherin 在不同分組中的mRNA 表達(dá)差異

2.3 蛋白表達(dá)差異

Western-blot 結(jié)果示，與A 組比較，B 組Skp2 和AKT 顯著上調(diào)，p27、FOXO1、E-cadherin 顯著下調(diào)，C組Skp2、AKT、E-cadherin 顯著下調(diào)，P21、P27、FOXO1顯著上調(diào)（P ＜0.05）；與B 組比較，D 組Skp2、p21、AKT 下調(diào)，p27、FOXO1、E-cadherin 顯著上調(diào)。見圖4。

2.4 骨肉瘤預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素

Cox 回歸分析結(jié)果示，Skp2、AKT 和p27 的風(fēng)險(xiǎn)比均＞1，且P <0.05 可能是OS 患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。見表2。

3 討論

化療可殺滅微小轉(zhuǎn)移灶，但常伴有耐藥的發(fā)生[12-13]。Skp2 與多種腫瘤耐藥相關(guān)，如前列腺癌、乳腺癌、OS等[14-15,8]。本研究首先識別了Skp2 在OS 和耐藥OS 中表達(dá)上調(diào)，且Skp2 高表達(dá)是預(yù)后較差的預(yù)測因素，表達(dá)下調(diào)對侵襲、肺轉(zhuǎn)移具有抑制作用[16]。

Skp2 泛素化促進(jìn)AKT 活化，與預(yù)后不良有關(guān)[17]。在食管鱗癌中，抑制AKT 磷酸化，可抑制Skp2 的表達(dá)，減緩細(xì)胞增殖[18]。AKT-Skp2 通路可能是改善OS化療效果的靶通路。另外，Skp2 抑制OS 細(xì)胞中E-cadherin、FOXO1、p21 和p27 表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[10,19]。然而，分子檢測示p21 在耐藥腫瘤組與非耐藥組間無明顯差異，提示p21 的生成和降解不僅受Skp2 的調(diào)節(jié)[20]。Skp2 通過對p27 的降解，在OS 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是OS 的重要預(yù)后指標(biāo)[21-22]。研究表明Skp2 通過降解E-cadherin 促進(jìn)細(xì)胞遷移[23]。E-cadherin 與EMT 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用，并與腫瘤細(xì)胞化療耐藥間存在著緊密聯(lián)系[24-25]。同時(shí)，Cox 分析結(jié)果顯示，性別、Skp2、AKT、p21 和p27 可能是OS 患者生存時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)因素，需要進(jìn)一步研究和探討。

圖4 Skp2、AKT、p21、p27、FOXO1、E-cadherin 在不同分組中的蛋白表達(dá)

表2 Cox 回歸分析

綜上所述，Skp2 的高表達(dá)與OS 新輔助化療耐藥密切相關(guān)，Skp2 可能是改善化療療效的潛在靶點(diǎn)。