數字油滴PCR 法與ARMS 法檢測結直腸癌BRAF 基因突變中應用價值

姜燕平 荀延萍 傅佳儀 張仕蓉 趙妍妍 馬勝林

1.浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院轉化醫學研究中心，浙江杭州 310006；2.浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院腫瘤科，浙江杭州 310006

結直腸癌是全球第二大常見癌癥[1]。與發達國家比較，中國患者病死率與死亡率較高[2-3]。改善結直腸癌患者治療效果的基石之一是找到腫瘤相關的基因突變[4]。絲/蘇氨酸特異性激酶（BRAF）在絲裂原活化蛋白激酶途徑的激活中起重要作用，有助于細胞生長，增殖和分化。BRAF V600E 突變是其主要突變類型，可以調節磷酸化使BRAF 活性提高近10 倍[5]。研究發現[6]，患有BRAF V600E 突變的結直腸癌患者的中位生存期比未突變的結直腸癌患者短10～16 個月。因此，選擇適當的BRAF 基因突變的檢測方法對結直腸癌的診斷和預后有重要意義。擴增阻礙突變系統（ARMS）被認為是一種經濟、簡便的檢測方法，在臨床實踐中得到了廣泛的應用[7-8]。近年來，數字油滴聚合酶鏈式反應法（ddPCR）發展迅速，且與ARMS 法比較，是一種不依賴于CT 值且不受擴增效率影響的絕對定量技術[9]。本研究采用ddPCR 法和ARMS 法分析比較結直腸癌患者BRAF 基因突變的檢測結果，以期為結直腸癌的診斷治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年4 月—2019 年7 月浙江大學醫學院杭州市第一人民醫院診治的結直腸癌患者手術標本162 例（倫理號：2018-15-02）。納入標準：接受手術治療，且病理學確診為結直腸癌。排除標準：①術前接受放化療或免疫治療；②合并其他惡性腫瘤；③術前有明確的遠處轉移，術后3 個月內出現遠處轉移；④骨髓功能異常或凝血功能異常；⑤嚴重的心、腦、肝和腎功能障礙；⑥資料不完整。患者年齡18～95 歲，平均（52.31±12.36）歲；男101 例，女61 例；發病部位：直腸62 例，乙狀結腸46 例，橫結腸29 例，升結腸16 例，盲腸9 例；乳頭狀腺癌82 例，高分化腺癌62 例，低分化腺癌18 例；隆起型75 例，浸潤型62 例，潰瘍型25 例；Ⅰ～Ⅱ期93 例，Ⅲ～Ⅳ期69 例。

1.2 觀察指標及檢測方法

分析ARMS 法和ddPCR 法結直腸癌患者BRAF V600E 突變檢測陽性率及一致性；分析BRAF V600E突變與結直腸癌患者臨床病理特征的關系。

ARMS 法：穿刺樣本的石蠟包埋組織切片要求≥3 mm 厚度，腫瘤細胞數≥200 個。取3 塊石蠟切片，使用QIAampDNAFFPETissueKit 試劑盒（德國QIAGEN 公司，貨號：56404）提取DNA。采用BRAF 基因突變檢測試劑盒（北京雅康博生物科技有限公司，生產批號：20171203） 結合實時熒光定量PCR 儀（Life Technologies Holdings Pte Ltd.，7500） 檢 測BRAF V600E 的突變情況。具體步驟：將提取的核酸稀釋至10 ng/mL，取20 mL 用于試驗產品檢測，反應程序：95℃10 min、95℃15 s、60 s 循環40 次。采集各樣本的Ct，突變位點存在擴增，且Ct 值≤35，該樣本突變型；Ct 值＞38 或無擴增，該樣本為野生型。

ddPCR 法：采用上海源奇生物醫藥科技有限公司提供的人BRAF 基因突變檢測試劑盒（生產批號：20180125）結合ddPCR 微滴閥讀儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司，QX-200）進行檢測。具體步驟：石蠟切片進行組織DNA 的提取同ARMS，取6 mL，2000 r/min離心10 s，加至PCR 預混液的PCR 管，反應體系總體積20 mL，進樣ddPCR 微滴閥讀儀，樣本落在“ch1+ch2-”區的點且突變比例為1%，該樣本突變型，否則為野生型。

高通量測序分析：當ARMS 法與ddPCR 法存在歧義時，采用高通量測序，對PCR 產物在質控后純化，在MiSeq 基因測序儀（美國Illumina 公司）進行測序，以高通量測序數據分析系統進行分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料以例數表示。通過χ2檢驗評價ARMS 法和ddPCR 法在評估結直腸癌的BRAF 基因突變的一致性及人BRAF V600E 突變與結直腸癌患者臨床病理特征的關系。采用正態近似法計算一致性的置信區間。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BRAF V600E 突變檢測結果

在162 例結直腸癌患者標本中，ARMS 法檢測BRAF V600E 突變陽性率為8.64%（14/162），ddPCR法檢測BRAF V600E 突變陽性率為9.26%（15/162）。對ARMS 法檢測BRAF V600E 突變存在歧義的1 例進行高通量測序，ddPCR 法與高通量測序的結果一致。對應ddPCR 法，ARMS 法的敏感性為100%（14/14）、特異性為99.32%（147/148）、準確性為99.38%（161/162）、假陰性率為6.67%（1/15）、陽性符合率為93.33%（14/15）和陰性符合率為99.32%（147/148）。ARMS 法和ddPCR 法檢測一致性為99.38%（161/162，95%CI：0.963～0.999）。見表1、圖1～2。

表1 BRAF V600E 突變檢測結果（n）

圖1 人BRAF V600E 突變

圖2 高通量測序人BRAF V600E 突變

2.2 人BRAF V600E 突變與臨床病理特征的關系

不同性別、部位、病理分型結直腸癌患者BRAF V600E突變分布比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。年齡越高、組織學類型低分化、Ⅲ～Ⅳ期患者BRAF V600E 突變分布越高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

3 討論

ARMS 檢測基因突變的基本原理在于，PCR 擴增引物是否延續與引物3′端的堿基與模板配對有關，不能配對則不能延伸，因此設計合適的引物即可用于區分突變與正常的DNA 序列。在本研究中，PCR 擴增時只擴增BRAF，無突變序列不擴增，PCR 產物未含未突變的等位基因片段，靈敏度較高，如張瑩等[10]采用ARMS 法從60 例結直腸癌患者手術切除組織中檢出3 例BRAF V600E 突變。但報道也顯示，ARMS 存在假陰性。如本研究結果顯示，ARMS 檢測BRAF V600E突變存在1 例假陰性，因此需要通過加大DNA 模版量、更換試劑盒、更換操作人員等克服假陰性的缺陷。

Kary 等于1985 年創立了PCR 來對核酸進行定量分析[11]。盡管此方法具有很高的靈敏度，但許多不準確的因素可能會影響對轉錄本數量的評估[12]。新一代的實時熒光定量PCR（qPCR），可以通過將qPCR 的熒光輸出曲線與不同的已知初始DNA 拷貝數生成的標準曲線進行比較從而確定DNA 模板的初始含量[13]。相較于普通PCR，qPCR 的檢測結果更為準確[14]。Vogelstein 等[15]于1999 年發展了ddPCR，在結直腸癌患者中成功檢測出具有高度敏感性的Ras 突變。ddPCR 的關鍵是將PCR 混合物與必要的熒光團分為數千個單獨的PCR 反應單元，每個單元都經歷與常規PCR 相同的熱循環[16-17]。與qPCR 比較，ddPCR 不依賴于CT 值，因此不受擴增效率影響，擴增結束后通過直接計數或泊松分布公式來計算每個反應單元的平均濃度，能夠將誤差控制在5%以內，具有高精度、高準確性，無需標準曲線的絕對定量以及出色的重現性和一致性的優點[18]。另外有研究發現，ddPCR 對不同類型的抑制劑比qPCR 可能具有更高的耐受性，可防止核酸提取過程中帶入的雜質（如離子去污劑、乙醇、異丙醇等）檢測結果的影響[19-20]。

表2 人BRAF V600E 突變與臨床病理特征的關系[例（%）]

本研究發現ddPCR 法與高通量測序結果一致，進一步證實ddPCR 的高精度和高準確性的優點。Xu等[21]研究顯示ddPCR 具有較高的重復性和靈敏性，160 例乳頭狀甲狀腺癌患者中檢出128 例BRAF V600E突變，其中4 例BRAF V600E 突變陽性患者ARMS檢出為陰性。毛旭華等[22]研究顯示，與ARMS 法比較，ddPCR 可檢出更多的EGFR T790 突變。曹紫陽等[23]從ARMS 法檢測的10 例EGFR T790 突變陰性病例中，以ddPCR 檢出陽性3 例。另外，本研究還發現年齡越高、組織學類型低分化、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者BRAF V600E 突變分布較高，與報道結果類似[5,24-26]。可見V600E 突變的BRAF 參與了結直腸癌的發生發展，通過檢測結直腸癌BRAF V600E 是否存在突變有助于個體化制訂治療方案及判斷預后。

綜上所述，ddPCR 與ARMS 均可用于檢測結直腸癌的BRAF V600E 突變，ddPCR 有更高的檢測效能。