冬蟲夏草水提物體外抗巨細胞病毒研究

陳智平，蔡豪斌，伍惠玲，王茂水，何 雨，李 山，秦 雪＊

（1.廣西醫科大學公共衛生學院，廣西 南寧530021；2.英美特生物技術研究所，廣西 桂林541001；3.廣西醫科大學第一附屬醫院 臨床實驗部，廣西 南寧530021；4.廣西醫科大學 醫學檢驗系，廣西 南寧530021）

巨細胞病毒在人群中具有極高的感染率，血清陽性率40%－100%不等，美國FDA批準用于抗巨細胞病毒的藥物較少，且這些藥物存在有較多的副作用：造血抑制、低生物吸收度、腎毒性、生殖毒性等。所以有必要篩選新型低毒的抗巨細胞病毒藥物。特別是從中草藥中篩選抗巨細胞病毒藥物。

冬蟲夏草（Cordycepssinensis）是我國一種名貴的中草藥材。目前有多種生物活性被報道：提高免疫力，抗腫瘤等。本研究既探討冬蟲夏草水提物的體外抗巨細胞病毒活性。

1 材料與方法

1.1 冬蟲夏草的水提物的制備

冬蟲夏草為桂林淮安公司贈送。冬蟲夏草子實體經高速組織搗碎機處理后，放于超純水（Milli－Q ultrapure water systems）中低溫浸提3次，每次24 h。每次浸提結束后，離心處理（3 000rpm，4℃，10 min），再重新浸取。最后合并3次浸取上清，凍干處理。使用時，稱量并溶于培養基（10%DMEM，10%胎牛血清）中，經0.22μm濾器過濾后使用。

1.2 原代細胞培養以及巨細胞病毒制備

人包皮成纖維細胞（HFFs）由桂林英美特生物技術研究所保存，所采用的細胞代數為6－14代。培養基為DMEM（美國Hyclone），含10%胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）、100U／ml青霉素、100 μg／ml鏈霉素。人巨細胞病毒tw－87購自ATCC，經過擴培后［1］，－80℃凍存備用，并且確定其滴度。

1.3 細胞毒性試驗

通過MTT法［2］檢測冬蟲夏草水提物的細胞毒性。在37℃，5%CO2培養條件下，HFFs（104／孔）接種至96孔板，待細胞貼壁后，加入同量梯度稀釋的冬蟲夏草水提物。經過72h孵育后，加入MTT（Sigma）溶液（5mg／ml）。孵育6h后，置酶標儀（Anthos Labtek HT2）讀取570nm處的光密度（OD）值。結果以均數±標準差表示。在不同時間，重復本試驗以驗證結果的可重復性。

1.4 噬斑減少試驗

巨細胞病毒（1PFU（Plaque Formation Unit）／細胞）接種至鋪滿成纖維細胞的24孔板，經過1.5h吸附后，加入同量梯度稀釋的冬蟲夏草水提物，每個濃度下有三個平行測試孔。孵育7天后，超聲處理貼壁的成纖維細胞，取各孔上清在新24孔板上檢測其滴度：添加上清后，孵育1.5h后，吸掉培養基，加入1%甲基纖維素、5%胎牛血清的DMEM培養基，7－10天后，用95%酒精固定15min，吉姆薩染色。計數噬斑數量。根據Reed－Münch法，計算半數抑制量（IC50）。

1.5 免疫印跡

人包皮成纖維細胞首先經過血清饑餓24h，然后添加巨細胞病毒（1PFU／cell），經過1.5h吸附后，加入等量冬蟲夏草水提物。分別在12h，24h，48h，72h收集細胞蛋白：加入2×Laemmli裂解液400μl，刮取細胞。經13 000rpm離心后。取上清，煮沸5min后，采用12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白樣品，然后轉印PVDF膜（（Millipore），經過5%脫脂奶粉（w／v）封閉后，分別加入一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗孵育。采用ECL（碧云天）顯色，曝光。

我們檢測了3種蛋白的表達（IE1，IE2，UL84），抗巨細胞病毒IE1鼠源單抗、抗巨細胞病毒IE2鼠源單抗、抗巨細胞病毒UL84鼠源單抗（由英美特生物技術研究所研制），分別用來檢測PVDF膜上的相應蛋白。當一種抗原檢測完畢后，將膜放入洗脫液（100mMβ－巰基乙醇，1.5%SDS，0.05MTris－HCl，pH 2.3）中，60℃孵育30min。經 PBST（含0.5%tween－20，1×PBS）洗2次后，封閉，重新用新的單抗孵育。ECL顯色，曝光。另外，選用β－actin（碧云天）作為免疫印跡的內參。

1.6 細胞活性檢測

同樣采用MTT法。根據巨細胞病毒添加量不同分5個組 （5PFU／細胞，1.25PFU／細胞，0.3125PFU／細胞，0.078PFU／細胞，0PFU／細胞），更換含有或者不含冬蟲夏草水提物的培養基。經過72h的孵育后，加入 MTT孵育6h，讀取OD值（570nm）。結果以均數±標準差（mean±SD）表示。

2 結果

2.1 細胞毒性檢測

冬蟲夏草具有較低的細胞毒性，當冬蟲夏草水提物濃度為2mg／ml時，在鏡下觀察細胞形態，細胞邊界清晰，但是有些細胞已經懸浮，細胞形態嚴重改變，胞質中有異物感，細胞發生嚴重的細胞病變。而在0.5mg／ml濃度下的細胞，與未添加藥物的正常細胞相比，沒有區別。MTT法證實（表1），當冬蟲夏草水提物濃度≤0.5mg／ml，發現與正常組相比，細胞的活性基本沒有變化。本研究為進一步減少冬蟲夏草水提物的細胞毒性，我們采用0.4mg／ml作為下續研究的測試濃度（免疫印跡，活化抑制試驗等）。

表1 冬蟲夏草水提物細胞毒性試驗（MTT法）

2.2 噬斑減少試驗

通過噬斑減少試驗，初步發現冬蟲夏草的半數抑制量（IC50）介于0.4mg／ml－0.1mg／ml之間。進一步縮小藥物濃度范圍，重復噬斑減少試驗，結果如表2所示。采用Reed－Münch法，計算得到IC50＝0.17mg／ml。

表2 噬斑減少試驗結果

2.3 免疫印跡

我們發現冬蟲夏草水提物可以輕微抑制IE1的表達；同時可以阻斷IE2／UL84的表達（低于免疫印跡的檢測限），與未用藥物處理組相比，冬蟲夏草處理組，在48hpi（hours postinfection），72hpi均未檢測到IE2／UL84的表達。而未用冬蟲夏草水提物處理組，在48hpi，72hpi，IE2／UL84都有較強的表達。同時，未添加病毒的細胞（mock），沒有檢測到IE1／IE2、UL84的表達。

2.4 活化抑制試驗

巨細胞病毒的感染可以活化細胞。我們采用MTT法檢測細胞活性，發現細胞活性的提高與巨細胞病毒的添加量有一定的關系。但是，培養基中含有0.4mg／ml冬蟲夏草水提物的細胞，感染巨細胞病毒后，細胞活性的增加不明顯，見表3。這說明冬蟲夏草可以阻斷巨細胞病毒引起的細胞活性增加。鏡下觀察，冬蟲夏草水提取物可以抑制細胞病變的產生（如圖2）。

圖1 “－”和“＋”分別代表不含冬蟲夏草水提物、含冬蟲夏草水提物。可以發現，冬蟲夏草水提物可以輕微抑制IE1的表達，可以抑制IE2、UL84的表達，以致低于檢測限度

圖2 左圖，巨細胞病毒添加量為：1.25PFU／細胞，含0.4mg／ml冬蟲夏草水提物。右圖，巨細胞病毒添加量為：1.25PFU／細胞，不含冬蟲夏草水提物。

表3 冬蟲夏草水提物抑制巨細胞病毒活化細胞試驗

3 討論

冬蟲夏草是我國一種名貴的中草藥材。鮮有報道其在抗病毒中的作用，在本研究中我們發現冬蟲夏草水提物可以有效抑制巨細胞病毒的復制。一種機制是通過抑制某些早期（IE1／IE2）或者早晚期蛋白（UL84）的表達，抑制巨細胞病毒的復制。另外一種可能是，冬蟲夏草具有多種生理活性作用，可影響細胞內的微環境，這提示蟲草可能通過改變細胞內微環境而影響巨細胞病毒的復制。

IE1／IE2，UL84對于巨細胞病毒的DNA復制非常重要。它們參與反式激活巨細胞病毒與宿主細胞，巨細胞病毒突變體CR208（IE1基因中缺乏外顯子4），具有較低的復制效率，這說明IE1在巨細胞病毒的復制過程中具有重要的作用［3］，作為反轉錄因子的一種，IE2反式激活絕大多數的巨細胞病毒啟動子，IE2的缺失會導致病毒不表達早期裂解基因，這意味著IE2也可影響巨細胞病毒的感染效率［4］。至于 UL84，它參與復制中心（replication center）的形成，UL84的缺失，會導致UL44和IE2不能參與復制中心的形成，而復制中心的形成對于巨細胞病毒的復制是必須的［5］。基于上述發現，我們檢測了IE1，IE2和UL84的表達水平。通過我們的研究表明，冬蟲夏草水提物可能通過抑制某些早期（IE1／IE2）或者早晚期蛋白（UL84）的表達，抑制巨細胞病毒的復制。

研究表明，巨細胞病毒可以活化細胞，比如，增加胞內Na＋的濃度，以及cAMP和cGMP的胞內濃度，促進宿主細胞DNA的合成，促進冠狀動脈平滑肌細胞的增殖，激活VEGF的轉錄等。有報道稱，當巨細胞病毒引起的活化信號被抑制時，或者生理反應被阻斷時，巨細胞病毒的復制量會降低，這也就是說巨細胞病毒引起的細胞生理反應也是一種潛在的抗巨細胞病毒的作用靶點［6］。因此巨細胞病毒引起細胞活性的增高應該是一種促進病毒增殖的一種手段。但是為什么冬蟲夏草水提物會抑制巨細胞病毒的活化作用呢？這意味著這種抑制細胞活性的上調可能是冬蟲夏草水提物的一種抗巨細胞病毒的靶位。但是免疫印跡的結果顯示冬蟲夏草水提物的抑制巨細胞病毒的靶位為一些早期蛋白（IE1／IE2）或者早晚期蛋白（UL84）。因此，細胞活性的相對降低可能是由于冬蟲夏草抑制這些重要蛋白的表達而引起的。但是也不能排除是由于冬蟲夏草對細胞內環境的影響［7－9］。這些只是我們的假設，還需要進一步的實驗來支撐。

綜上所述，我們發現了冬蟲夏草的一種新的生物活性：抗巨細胞病毒作用，并初步確定其抗巨細胞病毒的靶位，下一步我們將從中分離出有效的抗巨細胞病毒組份，以應用于臨床。

陳智平和蔡豪斌對本文有同等貢獻，并列第一作者。

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