大豆-乳清混合蛋白對O/W乳液穩定性及流變性的影響

李 良 張小影 朱建宇 韓 璐 李 楊,2 齊寶坤,2

(1.東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030； 2.國家大豆工程技術研究中心， 哈爾濱 150030)

0 引言

乳液是由油、水和乳化劑形成的熱不穩定體系，具有不同的類型，廣泛存在于工業化生產及日常生活中，如牛奶、冰激凌、藥品、化妝品等。乳液的穩定性在其應用中起著至關重要的作用，乳液組分的性質，如蛋白質的種類及性質、蛋白濃度、油相濃度等，都容易影響乳液的穩定性[1]。大豆分離蛋白(SPI)是一種營養豐富的食用蛋白資源，由于其蛋白含量較高，具有良好的乳化性，研究者將SPI作為乳化劑來穩定乳液[2]。單一的SPI由于受結構影響容易變質等問題，限制了其在乳液中作為乳化劑的應用。

乳清蛋白分離物(WPI)具有營養價值高、易消化、生物利用度高和多種生物活性等特點，是乳制品行業中制造增值產品的重要成分[3]。WPI具有兩親性，可以結合靜電和空間相互作用，穩定乳液，防止絮凝或聚結，從而為油滴提供保護[4]。因此，乳清分離蛋白可用作乳化劑來提高乳液的穩定性。王喜波等[5]研究了超聲處理改善不同比例大豆-乳清混合蛋白理化性質，但是沒有說明濃度與比例對乳液穩定性及流變特性的影響。JOSE等[6]研究了混合乳清和大豆蛋白凝膠機械反應和保水的結果，結果表明混合蛋白比單一蛋白效果好。

本文采用大豆分離蛋白-乳清分離蛋白(SPI-WPI)作為復合乳化劑，來提高O/W(水包油)乳液的穩定性。通過測定粒徑、Zeta電位、乳液穩定性系數、掃描電鏡、流變等指標，探討質量分數及混合蛋白比例對復合乳液穩定性及流變特性的影響，以確定最優的蛋白濃度和混合比例，從而為提高乳液穩定性和其應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(WPI-90)，南京松冠生物科技有限公司；大豆分離蛋白(SPI)，哈高科大豆食品有限責任公司；大豆油(九三一級壓榨油)，九三集團哈爾濱惠康食品有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，沈陽市騰誠化工原料有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FJ-200型高速分散均質機，上海標本模型廠；FB-110S型超高壓均質機，上海勵途機械設備工程有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；NANO-ZS90型馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文公司；UV-2550型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；食品氧化穩定性分析儀(OXITEST)，意大利VELP公司；SU8010型冷凍掃描電鏡，日立高新技術公司；DHR-1型流變儀，美國TA儀器公司；HAAKE MARS 40型旋轉流變儀，德國RHEOTEST公司。

1.3 實驗方法

1.3.1雙蛋白乳液的制備

將SPI與WPI分別按照1∶9、5∶5、9∶1質量比[6]混合作為實驗組，以單獨添加SPI為對照組。將混合物溶于100 mL去離子水中，使蛋白溶液質量分數分別達到1.5%、2.0%、2.5%，磁力攪拌1 h使其充分溶解，4℃貯藏備用。

將雙蛋白溶液與大豆油混合，制成初級乳狀液，使得大豆油占15%，混合蛋白溶液占1.5%、2.0%、2.5%。并利用高速剪切機剪切3 min，轉速為10 000 r/min。繼續利用高壓均質機在60 MPa條件下均質3次，制成最終乳狀液，再加入0.02%的疊氮化鈉以抑制微生物的生長，所得乳液在4.0℃下儲存[7]。

1.3.2粒徑與Zeta電位的測量

采用NANOA-ZS90型激光粒度分布儀測定乳液液滴粒徑與Zeta電位，將不同條件下制備的蛋白乳液稀釋1 000倍，乳液液滴的折射率為1.46，水分散介質的折射率為1.33[8]。將樣品放入樣品池中，在25℃條件下測定體積平均粒徑D4，3。

1.3.3乳化活性與乳化穩定性

參照文獻[9]的方法，吸取乳液20 μL，將其加入到4 mL 0.1% SDS溶液中混合均勻。在500 nm波長下測定吸光度A0，靜置30 min后測定吸光度A30，乳化活性指數(EAI)和乳化穩定性指數(ESI)計算公式為

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指數，m2/g

ESI——乳化穩定性指數，min

N——稀釋倍數，取200

C——乳狀液形成前蛋白質水溶液中蛋白質質量濃度，g/mL

φ——乳狀液中油相體積分數，取15%

1.3.4乳液穩定性系數

取2 mL乳液于圓底離心管中，4 000 r/min離心30 min，離心后在距離心管底部1 cm處取少量清液，裝入比色皿中，用紫外分光光度計測定離心前后乳液在500 nm波長處的吸光度[10]。乳液穩定性系數(FI)公式為

(3)

式中At——離心后乳液吸光度

1.3.5乳液氧化穩定性

采用OXITEST法，利用OXITEST氧化穩定性分析儀測定乳液氧化穩定性，將準備好的不同條件的乳液加入到樣品盤中，左、右各3個樣品盤，每個盤中稱量10.00 g乳液，溫度設定為90℃，壓力設定為6.00 MPa，觀測氧化曲線，計算乳液氧化誘導期[11]。

1.3.6液滴微觀分布

采用低溫掃描電鏡對SPI-WPI復合乳液的微觀結構進行表征。將樣品液滴置于試樣支架上，在液氮中冷凍，并轉移到制備室(PP3010T型低溫冷凍電鏡制備系統)。在破碎和升華之后，樣品表面噴金，然后用JSM-7100型掃描電子顯微鏡拍照[12]。

1.3.7乳液流變測定

利用DHR-1型流變儀測定不同濃度及比例的雙蛋白乳液穩態流變性質，取1.00 mL乳液置于樣品測試臺上，溫度設置為25℃，采用60.00 mm平行板夾具，狹縫距離設置為0.5 mm，剪切速率為0～100 s-1，測定樣品的流變特性[13]。

使用HAAKE MARS 40型旋轉流變儀，在實驗臺上取1.00 mL乳液加在測試臺上，溫度設定為25℃，以2℃/min的速度升溫至95℃，檢測整個降溫過程乳液體系的模量變化。采用60.00 mm平行板夾具，狹縫距離設置為0.50 mm，頻率為1.00 Hz，應力為0.050 Pa，在整個實驗過程中，需加蓋密封圈以防止水分過度蒸發，進行小變形振蕩掃描分析[13]。

1.4 統計分析

所有實驗均重復3次，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS 18.5軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，以p<0.05為差異顯著。采用Origin 8.5軟件進行制圖。

2 結果與討論

2.1 乳液粒徑和Zeta電位

粒徑是評價乳液穩定的重要因素，液滴粒徑越小，乳析速度越慢，乳液越穩定[5]。根據新鮮乳液的粒徑來評估SPI-WPI乳液的乳化性，結果如表1所示。實驗組與SPI對照組相比，實驗組的粒徑全部要比對照組小。這說明加入了WPI，乳液穩定性有所提高，可能是因為形成SPI-WPI復合物，產生抑制液滴聚集的空間位阻作用。隨著蛋白質量分數由1.5%增加至2.0%時，液滴D4,3減小，這可能因為油滴表面吸附蛋白質含量增大，足以包埋油滴表面，乳液穩定性增強[14]，隨后蛋白質量分數從2.0%增加至2.5%時，液滴D4,3增大，說明達到蛋白濃度最佳后繼續增加濃度，反而使得兩種蛋白吸附在油滴表面的量少不足以包埋油滴表面，乳液穩定性降低；隨著SPI與WPI質量比由1∶9增加至9∶1，D4,3呈增大的趨勢，質量比為1∶9時，蛋白相互作用達到最佳，乳液穩定性較好。當蛋白質量分數為2.0%、比例為1∶9時乳液D4,3最小，為(288.56±1.67)nm，表明適度的蛋白濃度及比例形成的乳液液滴D4,3較小，可能由于WPI添加量增加、SPI添加量相對減少，使得混合蛋白更容易吸附在乳液表面，復合物之間產生空間位阻作用，抑制了乳液液滴之間相互作用，有利于提高乳液的穩定性[15]。相反，當蛋白質量分數為1.5%、SPI與WPI質量比為9∶1時乳液D4,3最大，為(376.63±2.20)nm。

表1 不同條件下乳液的體積平均粒徑D4,3Tab.1 Volume average diameter of emulsion under different conditions nm

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

圖1 不同條件下乳狀液的Zeta電位Fig.1 Zeta potential of emulsions under different conditions

Zeta電位是判斷分散體系穩定性的重要指標，Zeta電位在一定程度上可以反映乳液液滴之間相互作用的強度。Zeta電位的絕對值越大，說明液滴間斥力越大，避免液滴聚結變大，體系越穩定[16]。不同蛋白濃度和比例制備乳液結果如圖1(圖中不同字母表示差異顯著(p<0.05)，下同)所示。SPI-WPI復合乳液液滴表面帶有負電荷，實驗組Zeta電位絕對值比SPI對照組絕對值大。蛋白質量分數由1.5%增加至2.0%時，SPI與WPI質量比為1∶9時，Zeta電位絕對值由25.0 mV增加至35.0 mV，達到最大，產生的靜電斥力大[17]。蛋白質量分數增加至2.5%時，Zeta電位絕對值為32.5 mV，表示乳液穩定性較好，在此濃度下可能更多的SPI-WPI蛋白被吸附到乳液液滴的表面上，提高Zeta電位絕對值及增大油滴的表面電荷，這有助于增加液滴間的排斥力并防止液滴聚集，提高乳狀液體系的穩定性；隨著SPI與WPI質量比的逐漸增加，Zeta電位絕對值逐漸降低，質量比為1∶9時Zeta電位絕對值最大，比例為9∶1時Zeta電位絕對值最小。綜上所述，蛋白質量分數為2.0%、SPI與WPI質量比為1∶9時，Zeta電位絕對值最大為35.0 mV，說明此時顆粒之間的靜電斥力最大，體系中分子不易聚集[18]，穩定性最好，此結果與乳液液滴體積平均粒徑一致。

2.2 乳化活性和乳化穩定性分析

影響混合體系乳化性的因素有很多，如SPI與WPI的結合程度、分子顆粒分布、蛋白質空間構象等[19]。不同條件制備乳液的乳化活性指數(EAI)和乳化穩定性指數(ESI)結果如圖2所示。結果表明，實驗組EAI和ESI數值都比SPI對照組高，可能由于WPI的加入使蛋白質分子間的靜電相互作用增強。隨著蛋白濃度的增加，乳液的EAI先增加后降低，隨著質量比例的增加，乳液的EAI逐漸降低。其中，蛋白質量分數為2.0%、SPI與WPI質量比為1∶9時的乳液EAI最大，為108.23 m2/g，因為此條件下乳液的蛋白質-蛋白質相互作用顯著增加，從而減緩由于重力或布朗運動造成的液滴聚結、絮凝等不穩定現象的發生[20]。蛋白質量分數為2.5%、SPI與WPI質量比為9∶1的乳液EAI最小，為59.07 m2/g。SPI與WPI質量比為1∶9時的乳液EAI更高，說明雖然SPI添加量相對較少，但添加WPI越多，乳液的EAI越好，WPI對乳液的EAI貢獻更大。隨著蛋白濃度的增加，乳液的ESI呈先上升后降低的趨勢；隨著質量比的增加，乳液的ESI逐漸降低。其中，蛋白質量分數為2.0%、比例為1∶9的乳液ESI最大，為3 784.71 min。蛋白質量分數為2.5%、比例為9∶1的乳液ESI最小，為1 394.40 min，乳液的乳化穩定性較好。其他條件下，乳液的穩定性降低，可能由于乳液液滴之間相互作用出現分層、脂肪上浮等現象。

圖2 不同條件下乳液的EAI和ESIFig.2 EAI and ESI of emulsions under different conditions

2.3 乳液穩定性系數

圖3 不同條件下乳液的穩定性系數Fig.3 Stability coefficient of emulsions under different conditions

不同條件制備乳液的穩定性系數如圖3所示。結果表明，隨著蛋白濃度逐漸增加，SPI-WPI復合乳液的穩定性系數呈現出先上升后降低的趨勢。實驗組1∶9的乳液穩定性系數最高，乳液液滴粒徑小，分散均勻，穩定性高。隨著SPI與WPI質量比的增加SPI-WPI復合乳液的穩定性系數逐漸降低。在蛋白質量分數為2.0%，SPI與WPI質量比為1∶9的條件下，SPI-WPI復合乳液的穩定性系數最大，為93.59%，乳液穩定性較好，可能是因為此條件下蛋白濃度和比例適宜，蛋白質吸附至兩相界面較多，并降低界面張力，促使液滴形成，并起到油滴保護膜的作用，防止油滴被破壞，使乳狀液處于穩定狀態[14]。而在蛋白質量分數為2.5%，SPI與WPI質量比為9∶1 的條件下，SPI-WPI復合乳液的穩定性系數最小，為74.40%，乳液穩定性與其他條件相比較差，可能由于蛋白質量分數過量，達到飽和后多余的蛋白由于彼此間的電荷排斥反而會破壞乳狀液的穩定性[21]。一定條件下，蛋白濃度的增加，如本文中蛋白質量分數為2.0%，會增加兩種蛋白粒子碰撞的機會，促進兩種蛋白粒子相互作用進而影響粒子間的相對距離，使混合蛋白穩定性增強，這與文獻[21]研究結果一致。此結果與本文乳化活性數據一致。

2.4 乳液氧化穩定性

圖4 不同條件下乳液的微觀狀態Fig.4 Microscopic state of emulsions under different conditions

油脂氧化穩定性與產品的貨架期密切相關，通過預測產品氧化穩定性可評估產品的貨架期[11]，誘導期越長，說明乳液越穩定。乳液油脂氧化程度如表2所示。由表2可以看出實驗組1∶9時比對照組誘導期更長，乳液更穩定，表明添加WPI有增加乳液穩定性的作用，可能由于單獨SPI氧化較嚴重，產生較多的揮發性二級氧化產物。蛋白質量分數為2.0%、SPI與WPI質量比為1∶9的乳液誘導期最長，為(581±2) min，說明此時的乳液是比較穩定的，表明提高WPI濃度及添加比例，SPI添加比例相對較少時，有利于抑制乳液油脂氧化，這與文獻[22]的研究結果一致。蛋白質量分數為1.5%的乳液誘導期為(579±2) min，蛋白質量分數為2.5%、SPI與WPI質量比9∶1的乳液誘導期最短，為(432±4) min，表明此時的乳液相對于其他條件下的乳液較不穩定。

2.5 掃描電子顯微鏡

掃描電鏡(SEM)常用于分析乳液的微觀結構，它能直接反映乳液顆粒尺寸、分散性和不穩定性。

表2 乳液氧化誘導期Tab.2 Oil oxidation of emulsion min

圖4分別是對照組及實驗組乳液液滴的微觀分布狀態。由圖4可知，SPI-WPI復合乳液液滴是球形，表面光滑，這與文獻[6]等研究結果類似。實驗組的分散情況及液滴尺寸大小較對照組相比較好。隨著蛋白濃度的增加，液滴尺寸先減小后增大。隨著SPI與WPI質量比的增加，液滴尺寸逐漸增大且出現液滴聚集的現象。當蛋白質量分數為2.0%、SPI與WPI質量比為1∶9時，可以看出乳液液滴尺寸較小且分布均勻。這可能是由于復合物濃度適宜且添加WPI量多在油-水界面形成更加致密的膜結構[23]。當蛋白質量分數為1.5%、SPI與WPI質量比為9∶1時，可以看出乳液液滴尺寸較大且分布聚集，形成乳液的界面膜不夠穩定，發生了油滴之間的聚集或絮凝[24]，此現象證實了用馬爾文激光粒度儀測定的粒徑結果。

2.6 乳液流變分析

2.6.1乳液穩態流變

圖5 不同條件下乳液的剪切速率對粘度及應力的影響Fig.5 Effects of shear rate of emulsion on viscosity and stress under different conditions

流變學是研究物質在外力作用下變形和流動的科學，根據流變曲線形狀，流體可分為牛頓流體和非牛頓流體兩類。非牛頓流體的粘度不僅取決于溫度，還取決于剪切速率和剪切應力，它又可分為膨脹型流體、塑性流體及假塑性流體等主要類型[25]。不同條件下乳液的剪切速率對粘度及應力結果如圖5所示，乳液的粘度隨著剪切速率的增加而降低，表現出剪切稀釋現象，屬于假塑性流體。這與文獻[26]研究結果類似。對照組比實驗組1∶9、5∶5的粘度及應力大，但是遠不如實驗組9∶1的大，可能是因為加入了WPI，其與SPI混合，發生相互作用。隨著蛋白質量分數的增加，乳液的粘度和應力先增加后下降。當蛋白質量分數為1.5%～2.0%時，液滴表面吸附的蛋白量較少，乳液出現絮凝現象，粘度和應力增加，當蛋白質量分數達到2.5%，表面蛋白吸附量達到飽和，液滴帶同種電荷，互相排斥，粘度和應力減小。隨著SPI與WPI質量比增加，乳液粘度和應力逐漸增加，說明乳清分離蛋白加入量多，有助于乳液粘度和應力的提高。其中，當蛋白質量分數為2.0%、SPI與WPI質量比為9∶1時，乳液的粘度和應力最大，當蛋白質量分數為2.5%、SPI與WPI質量比為1∶9時，乳液的粘度和應力最小，原因可能是凝集狀態的油滴在剪切過程中相互分離[27]。但總體上乳液的粘度和應力都較低，乳液呈現流體狀態。

2.6.2乳液動態流變

乳液的粘彈性可以用儲能模量G′和損失模量G″來表征，SPI-WPI復合乳液的溫度對乳液儲能模量(G′)及損耗模量(G″)的影響見圖6。由圖可知，乳液的G′隨著溫度的增加而緩慢增加。實驗組比對照組高，可能是由于添加WPI，WPI的彈性較好，使混合蛋白彈性模量增加。隨著蛋白質量分數的增加，乳液的G′及G″先增加后下降。隨著SPI與WPI質量比增加，乳液G′及G″逐漸增加。其中，當蛋白質量分數為2.0%、SPI與WPI質量比為9∶1時，乳液的G′及G″最大，當蛋白質量分數為2.5%、SPI與WPI質量比為1∶9時，乳液的G′及G″最小。乳液的G′及G″隨著溫度的升高(70℃以下)而降低，這表明保持乳液蛋白結構的強度降低，并且維持乳液蛋白結構的力是一些比較弱的作用力，如氫鍵。而溫度從70℃升到95℃又逐漸增大，這很可能是由于蛋白開始變性和結構進一步展開，這也表明，隨著溫度升高，有更多的蛋白和蛋白包裹油滴進入乳液網絡結構中[28]。

圖6 不同條件下乳液的溫度對彈性模量及損耗模量的影響Fig.6 Effects of temperature of emulsion on modulus of elasticity and modulus of loss under different conditions

3 結論

(1)添加WPI改變了乳液的穩定性和流變特性，說明蛋白質量分數及兩種蛋白質的質量比對乳液穩定性及流變特性有顯著影響。

(2)當SPI-WPI乳液質量分數為2.0%、SPI與WPI質量比為1∶9時，乳狀液穩定性、乳化性、微觀狀態、氧化穩定性最好。

(3)當SPI-WPI乳液蛋白質量分數為2.0%、SPI與WPI質量比為9∶1時，乳狀液的流變特性最好，乳液粘度及剪切應力呈現最大值。