基于高光譜成像的生鮮雞肉糜中大豆蛋白含量檢測

王 偉 姜洪喆 賈貝貝 鹿 瑤

(1.中國農(nóng)業(yè)大學工學院， 北京 100083； 2.中國農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備優(yōu)化設(shè)計北京市重點實驗室， 北京 100083；3.南京林業(yè)大學機械電子工程學院， 南京 210037)

0 引言

雞肉具有低脂肪、高蛋白等特點，是人類膳食營養(yǎng)的重要來源。雞肉加工時僅依賴自身蛋白質(zhì)很難形成完好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，影響其食用品質(zhì)[1]。大豆蛋白具有良好的吸水性、吸油性、乳化性和凝膠性，適量添加到肉制品中可以改善其色香味等食用品質(zhì)[2]。目前，國內(nèi)一些不法商家為了掩蓋注水增重等摻假行為，擅自添加大豆蛋白，以增重牟利，卻不在添加劑中注明，這不僅嚴重侵害了消費者權(quán)益，也增添了消費者過敏的健康風險[3-4]。一些國家對含肉糜食品，如肉餅、香腸、餡餅等中添加非肉蛋白質(zhì)是有嚴格規(guī)定的。例如，西班牙熟火腿最多允許添加1%的大豆蛋白，美國對香腸肉丸等肉制品也明確規(guī)定了可摻入大豆蛋白的百分比等[5]。研究生鮮雞肉糜中摻入大豆蛋白含量的檢測很有實際意義，肉糜改變了原有的肌肉形態(tài)特征，增大了鑒別的難度，因此亟待探索無損檢測技術(shù)的可行性。

國內(nèi)外學者對檢測肉品或肉制品中大豆蛋白含量的方法進行了諸多嘗試，如聚合酶鏈式反應(PCR)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法、酶聯(lián)免疫(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)等。這些方法操作繁瑣且耗時，可以很好地定性鑒別，但定量預測效果并不突出[6-10]。近紅外光譜(NIRS)是近些年發(fā)展起來、可廣泛應用于食品檢測領(lǐng)域的無損檢測技術(shù)，文獻[11-13]研究了近紅外光譜在原料肉中檢測大豆蛋白的可行性，檢測結(jié)果一般。高光譜成像技術(shù)融合了光譜和圖像，可以獲取目標樣品內(nèi)部生物化學信息和外部的物理結(jié)構(gòu)信息[14-17]，彌補了NIRS方法單點檢測的劣勢，目前針對雞肉糜中大豆蛋白含量的檢測尚未見報道。

本文采集生鮮雞肉糜中摻入不同種類、不同梯度大豆蛋白樣品的高光譜圖像，結(jié)合化學計量學算法，建立定量預測模型，并對預測結(jié)果進行可視化處理，以探究高光譜成像技術(shù)定量檢測生鮮雞肉糜中大豆蛋白摻假的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品準備

生鮮雞胸肉(保存于0～4℃，含水率為70%)采購于北京當?shù)氐某校徺I了市場上肉制品中最常用的3種粉狀大豆蛋白產(chǎn)品(圖1)：大豆蛋白粉(Soybean protein flour，SPF)、大豆?jié)饪s蛋白(Soybean protein concentrate，SPC)和大豆分離蛋白(Soybean protein isolates，SPI)，測量粒度均在125～150 μm之間。SPF(產(chǎn)地河北，食品級，55%)、SPI(產(chǎn)地山東，食品級，90%)、SPC(產(chǎn)地河北，食品級，99%)均購于河北潤贏生物科技有限公司。雞胸肉用刀片切成小塊，隨后使用國產(chǎn)絞肉機絞碎30 s備用。

圖1 3種大豆蛋白粉末Fig.1 Three kinds of soybean protein powder

將雞肉糜與大豆蛋白分別稱量并充分混合，得到總質(zhì)量為40 g，大豆蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%和100%的樣品。將樣品用叉子依次進行攪拌，以得到近似均質(zhì)的混合樣品。每個梯度下制備8個重復樣品分別裝入圓形有蓋培養(yǎng)皿(直徑9 cm，高度1.4 cm)中平鋪，最終每種大豆蛋白摻假樣本均獲得128個樣品，貼好標簽以備后續(xù)高光譜圖像數(shù)據(jù)采集。

1.2 高光譜圖像采集與校正

圖像采集使用的是推掃式線掃描高光譜成像系統(tǒng)，波段為380～1 012 nm，采集模式為漫反射模式。該系統(tǒng)主要由Image-λ-V10-IM型成像光譜儀(芬蘭OULU公司)、Imperx Ltd 型CCD檢測器(美國FL公司)、XENOPLAN型可變焦的長鏡頭(德國Bad Kreuznach公司)、WN500TA1000H型平移臺(北京微納光科公司)、一對Watsonville型500 W鹵鎢燈(美國CA公司)以及一臺安裝了高光譜圖像采集軟件的計算機組成。光譜分辨率為1.9 nm，像素分辨率為0.14 nm/像素，光源分別以與水平方向呈45°角安裝于光譜儀兩側(cè)，樣品表面與鏡頭表面距離為350 nm，曝光時間設(shè)定為32 ms，電動平移臺的速度為12 mm/s。由于系統(tǒng)兩端光譜區(qū)域(380～400 nm和1 000～1 012 nm)信噪比較低，因此僅保留400～1 000 nm(285個波段)光譜范圍內(nèi)的圖像用于數(shù)據(jù)分析。

為了消除CCD相機暗電流影響，需借助白、黑參考圖像進行高光譜圖像的黑白校正。采集特氟龍板的圖像作為白參考，并用鏡頭蓋遮擋相機鏡頭后采集黑參考圖像。并對高光譜圖像校正，公式為

(1)

式中Rc——校正后的高光譜圖像

R0——未校正前的采集圖像

D——采集的黑參考圖像

W——采集的白參考圖像

1.3 圖像處理和光譜數(shù)據(jù)提取

由于樣品與背景之間具有較大的光譜差異，因此肉樣部分很容易被識別出來。對700 nm波長(高反射率)下的圖像與405 nm波長下(低反射率)的圖像進行扣減運算，在波段運算圖像(圖2a)上以0.25作為閾值，提取大于0.25部分作為樣品的感興趣區(qū)域(Region of interest, ROI)，對每一個樣品構(gòu)造掩膜，提取其平均光譜的同時可去除背景、培養(yǎng)皿邊緣像素點(圖2b)。每個樣品中提取ROI的平均光譜作為該樣品的光譜，最終得到不同摻假梯度雞肉糜樣品的光譜矩陣。

圖2 波段運算后圖像與掩膜圖像Fig.2 Band math image and mask image

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

圖3 不同大豆蛋白含量樣品的原始平均光譜曲線Fig.3 Average raw spectra of different soybean protein content samples

2 結(jié)果與分析

2.1 原始光譜分析

圖3為生鮮雞肉糜分別摻雜質(zhì)量分數(shù)3%、6%、10%、20%、30%以及100%的3種大豆蛋白(SPF、SPC和SPI)的原始平均光譜。同時，為便于比較摻雜比例引起的光譜反射特征及強度變化，在每幅圖中均同時繪制了純生鮮雞肉糜的原始光譜，以利于直觀比較。

由圖3可見，雞胸肉的反射光譜強度低于3種大豆蛋白粉，具有肌紅蛋白(490 nm和560 nm)以及水(760 nm和980 nm)等對應的特征吸收峰/反射谷。當摻雜大豆蛋白含量較少時，例如蛋白質(zhì)量分數(shù)3%、6%和10%(圖1a～1c)摻雜樣本的光譜峰、谷位置和曲線形狀與純生鮮雞肉糜的原始光譜基本一致，表明摻雜量較少時光譜特征主要體現(xiàn)的是純生鮮雞肉糜。隨著摻入蛋白含量的顯著增加，如圖1d～1f，即分別摻入蛋白質(zhì)量分數(shù)20%、30%、100%時，純生鮮雞肉糜的光譜特征逐漸消失，被3類大豆蛋白的在可見光范圍較為平滑的光譜特征所取代，3種大豆蛋白粉末在400～1 000 nm波段無明顯特征吸收峰，光譜曲線形狀相似，而且隨著摻雜比例的逐漸增加，摻雜樣本的反射率逐漸升高，當?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分數(shù)為100%時，3類蛋白的反射率均高于純雞肉糜，這可能與肉糜中水分逐漸被干蛋白粉吸收有關(guān)。進一步研究摻入較高含量3類大豆蛋白的樣本(圖1c～1f)發(fā)現(xiàn)，摻入SPC蛋白與SPI蛋白的肉糜光譜曲線重合度較高，這與兩種蛋白自身物質(zhì)組成相近，即均以高濃度蛋白為主有關(guān)；二者均與摻入SPF的光譜曲線存在較大差異，這可能與SPF蛋白含量低、組成成分相對復雜有關(guān)。

因此，通過對原始光譜比較可以推測出在雞肉中摻入逐漸加大梯度的大豆蛋白會造成光譜反射率的逐漸升高以及特征峰的逐漸弱化，這有利于快速準確定量預測雞肉中不同大豆蛋白的摻假含量梯度。

2.2 全光譜定量模型建立

表1 基于原始及預處理全光譜建立的PLSR模型性能Tab.1 Results of PLSR models based on full raw and preprocessed spectra

2.3 特征波長選取

進一步以優(yōu)選全光譜模型為基礎(chǔ)，應用2DCOS(二維相關(guān)光譜)提取特征波長，摻入3種不同大豆蛋白(質(zhì)量分數(shù)0～30%)樣品的2DCOS同步譜及其對應的三維立體圖如圖4所示。在SPF的2DCOS譜圖中(圖4a)，對角線上產(chǎn)生了6個自動峰(515、617、661、809、871、980 nm)，這些波長點處的微小變化在相應的功率譜(圖5)上觀測更明顯，這說明隨著摻入量的增加，這些波段下的反射強度出現(xiàn)了顯著變化，因此推斷這些波長用來定量分析SPF摻假梯度時是有效的。這些顯著變化也反演展示出不同摻假梯度下的樣品中顏色變化(515、617、661 nm處)和含水率(980 nm處)有差異[19]。同理，針對SPC和SPI兩種大豆蛋白，也用此種方法分別選出了5個波長(圖4b、4c)，所有選取的特征波長如表2所示。

圖4 2DCOS同步譜等高線圖與其對應的三維立體圖Fig.4 Wavelengths selection using 2DCOS synchronous contour plots and 3D stereo plots

圖5 功率譜Fig.5 Power spectrum

對比摻雜的功率譜(圖5)發(fā)現(xiàn)，SPC、SPI的功率譜形狀相近，而SPF與這兩者的功率譜差別較為明顯。其原因在于：3種大豆蛋白內(nèi)部組成不同，大豆蛋白(SPF)為大豆除去油脂后的豆粕直接加工而成，其蛋白質(zhì)量分數(shù)約為43%；而大豆?jié)饪s蛋白(SPC)是去除大豆粉中的低聚糖以及水溶性小分子蛋白，將大豆蛋白中的粗蛋白進一步濃縮所得到，其蛋白質(zhì)量分數(shù)高達70%左右；大豆分離蛋白(SPI)是在大豆?jié)饪s蛋白SPC的基礎(chǔ)上，進一步去除掉大分子粗蛋白后得到，其蛋白質(zhì)量分數(shù)更是高達90%左右，因此，相比SPF，SPC和SPI的光譜特征更為接近。其次，SPF功率譜(圖5a)所

表2 特征波長選擇Tab.2 Summary of key wavelengths selection

呈現(xiàn)的位于可見光范圍的特征波長515、617、661 nm處相對峰值較高，是因為SPF蛋白為深黃甚至橙色，相比較SPC、SPI兩種蛋白顏色偏深。同樣地，SPF功率譜所呈現(xiàn)的特征波長809 nm對應RNH2鍵，表征SPF中的糖類。因此，當3種蛋白分別摻入生鮮雞肉糜中時，SPF的功率譜與SPC、SPI明顯不同。

進一步分析表2可看出，所有3種大豆蛋白選取特征波長均包含了980 nm，表明無論何種大豆蛋白摻入梯度越高的情況下含水率會越低。除此之外， SPF和SPI樣品選取的特征波長都含871 nm，而SPC和SPI樣品中選取的波長都含425 nm和572 nm，其他選取出的波長不相同，這表明不同種類大豆蛋白的摻入對整個樣品系統(tǒng)的影響具有一定的相似性，又因成分不同具有一定差異。

2.4 多光譜定量預測模型

表3 基于選擇波長建立的PLSR模型性能Tab.3 Performance of PLSR models developed by selected wavelengths

2.5 檢測限計算

圖6 雞肉糜中摻假大豆蛋白SPF、SPC和SPI檢測的簡化模型性能Fig.6 Results of simplified models for detection of SPF, SPC and SPI adulteration in minced chicken meat

為進一步觀察PLSR多光譜預測模型性能，分別繪制了如圖6所示的3種大豆蛋白模型中訓練集、交叉驗證集和預測集帶有誤差棒的預測數(shù)據(jù)與真實數(shù)據(jù)相關(guān)圖。檢測限(Limit of detection, LOD)是衡量檢測方法能力的重要指標，為了評估其靈敏度，本研究中LOD計算公式[20]為

(2)

式中δ——空白樣本預測的標準偏差

S——訓練集擬合曲線的斜率

由訓練集和交叉驗證集可以看出，二者檢測誤差相差較小，表明了模型的可靠穩(wěn)定性。為了進一步驗證檢測方法，僅對未參與建模的獨立預測集LOD進行了計算，得到應用該方法預測雞肉糜中SPF、SPC和SPI的LOD分別為0.53%、0.58%和1.02%。可以看出SPF和SPC的LOD均在1%以下，而SPI的LOD在1%左右，現(xiàn)實中以盈利為目的進行的肉類摻假行為摻假率一般都會高于10%，因此使用高光譜成像檢測雞肉糜中大豆蛋白含量是可滿足實際需求的，尤其對摻假率在1%以上樣品的定量檢測效果更佳。

2.6 摻假梯度可視化表征

將SPF、SPC和SPI對應的最優(yōu)簡化PLSR預測模型應用到原始多光譜圖像上，針對每一個像素點的大豆蛋白摻入含量進行定量預測，最終拼接成一幅預測分布圖。如圖7所示，選擇了10個摻假梯度(蛋白質(zhì)量分數(shù)0、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%和30%)進行示例展示。可視化圖中背景用黑色、低梯度用藍色，而高梯度用紅色表示，可見采用此種線性顏色能夠看到不同大豆蛋白梯度下的整體顏色變化，隨梯度的升高樣品由藍色向黃紅色轉(zhuǎn)變，可清晰看出是否摻假及其摻假水平。樣品內(nèi)各像素點顏色也有差異預示著不同點處的摻假情況也有不同，證實大豆蛋白粉在雞肉糜中分布也是不均勻的。在SPF和SPC的可視化圖中，質(zhì)量分數(shù)為零的樣品幾乎全是深藍色，而SPI中質(zhì)量分數(shù)為零與質(zhì)量分數(shù)為2%的樣品可視化效果接近，說明該方法對SPF和SPC的定性檢測以及微量的定量檢測效果要優(yōu)于SPI，這也與表3中最優(yōu)模型預測結(jié)果相一致。通過構(gòu)建大豆蛋白摻假梯度可視化分布圖的方法，可直觀展示與雞肉顏色相近的大豆蛋白粉的摻入狀況，為雞肉糜的品質(zhì)安全檢測提供了參考。

圖7 雞肉糜中大豆蛋白的可視化分布圖Fig.7 Visualization of soybean proteins distribution in minced chicken meat

3 結(jié)束語