MTHFR C677T基因多態(tài)性與腦小血管病認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性研究

汪明玉，張立輝，周浩，趙勇

腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）屬于隱襲性腦血管疾病之一，可導(dǎo)致隱匿性卒中、認(rèn)知功能障礙、癡呆及步態(tài)障礙等臨床疾病和癥狀。近年來(lái)，CSVD作為認(rèn)知障礙的重要病因，越來(lái)越受到關(guān)注[1]。盡管CSVD是導(dǎo)致人群認(rèn)知功能下降的一個(gè)重要因素，但其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚[2]。研究者認(rèn)為腔隙性梗死灶、微梗死、血管周?chē)g隙擴(kuò)張、神經(jīng)髓鞘脫失、腦動(dòng)脈硬化、腦淀粉樣血管病變等神經(jīng)影像學(xué)及神經(jīng)病理學(xué)改變都是CSVD認(rèn)知功能障礙的早期表現(xiàn)，但這些改變都缺乏特異性[3]。因此，探索有效的CSVD早期檢測(cè)指標(biāo)為干預(yù)性治療提供機(jī)會(huì)，是十分必要的。高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）與CSVD 認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)研究的證實(shí)，但是由于影響外周Hcy混雜因素較多，其準(zhǔn)確性受到質(zhì)疑。近年來(lái)，已有研究發(fā)現(xiàn)Hcy相關(guān)基因MTHFRC677T基因的突變與CSVD的發(fā)病相關(guān)[4-5]，而基因檢測(cè)可以有效避免各種血管病混雜因素的影響。基于此，本文就MTHFRC677T基因與CSVD認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 研究對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 連續(xù)入組2017年12月-2019年3月就診于濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的門(mén)診及住院CSVD患者進(jìn)行前瞻性研究，CSVD影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)腦小血管病診治共識(shí)》[6]。

入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡50～85歲；②顱腦MRI檢查顯示新發(fā)的小的皮質(zhì)下腔隙性梗死、可能為血管起源的腔隙、可能為血管起源的腦白質(zhì)高信號(hào)、血管周?chē)g隙、腦微出血的CSVD患者；③未服用過(guò)影響認(rèn)知功能的藥物；④患者本人或其家屬能配合神經(jīng)心理學(xué)檢查；⑤患者或其家屬簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①大面積皮質(zhì)或皮質(zhì)下梗死者及多發(fā)性硬化、顱內(nèi)腫瘤等可能引起腦白質(zhì)高信號(hào)者；②嚴(yán)重的視力、聽(tīng)力障礙，嚴(yán)重失語(yǔ)或肢體功能障礙而影響檢查者；③由腦血管病以外的其他原因?qū)е碌恼J(rèn)知障礙（如帕金森病、癲癇、精神病史、甲狀腺功能低下、酒精依賴(lài)或藥物濫用等）；④?chē)?yán)重心臟、肝臟及腎功能不全者；⑤重度癡呆，臨床癡呆評(píng)定量表（clinical dementia rating，CDR）為3分者；⑥服用對(duì)Hcy代謝有影響的藥物者。本研究獲得濰坊市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1．2 分組 納入研究的CSVD患者認(rèn)知功能障礙診斷及分級(jí)參照蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）評(píng)分及CDR評(píng)分。根據(jù)MoCA評(píng)分及CDR評(píng)分進(jìn)行分組。MoCA評(píng)分≥26分（CDR評(píng)分=0分）者為認(rèn)知功能正常組；MoCA評(píng)分20～25分（CDR評(píng)分=0分）者為輕度認(rèn)知功能障礙組；MoCA評(píng)分＜20分（CDR評(píng)分=0．5～2分）者為癡呆組。MoCA及CDR量表均由經(jīng)過(guò)神經(jīng)心理量表培訓(xùn)的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師完成。

1．3 研究方法

1．3．1 基線資料 記錄所有入組患者的年齡、性別、受教育年限、吸煙（連續(xù)或累積吸煙≥6個(gè)月）、飲酒（每月飲酒量＞1．5 kg，連續(xù)1年以上者）、婚姻狀況等資料及高血壓、糖尿病等危險(xiǎn)因素[7]。所有入組者清晨空腹采集肘靜脈血，采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)血清Hcy、TC及TG水平。Hcy≥17 μmol/L，為HHcy。高膽固醇血癥為T(mén)C＞6．3 mmol/L，高三酰甘油血癥為T(mén)G＞1．82 mmol/L。

1．3．2 磁共振檢查 使用Siemens MAGNETOM Spectra Skyra 3．0T磁共振掃描儀進(jìn)行頭顱M R I檢查。由2 名接受過(guò)神經(jīng)影像培訓(xùn)的神內(nèi)科醫(yī)師評(píng)定，意見(jiàn)不一致時(shí)會(huì)商確定。MRI檢查序列包括：①橫斷面快速梯度回波（fast field echo，F(xiàn)FE）T1WI；②快速自旋回波（turbo spin-echo，TSE）T2WI；③FLAIR T2WI；④增強(qiáng)T2加權(quán)血管成像序列（enhanced T2star-weighted angiography，ESWAN）3D梯度回波（gradient echo，GRE）序列。

1．3．3MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測(cè) ①樣本的制備：采集空腹靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，ED TA）抗凝管中，并用DNA純化提取試劑盒提取基因組DNA。根據(jù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)及Hinf1限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度進(jìn)行MTHFR基因多態(tài)性分析。②PCR擴(kuò)增：向MTHFR擴(kuò)增液中加入Taq酶、基因組DNA，混勻，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。③雜交、顯色：將MTHFR基因芯片放入雜交儀片架中，將雜交緩沖液及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻制成雜交反應(yīng)液，加入試管中，放入雜交儀運(yùn)行雜交程序；反應(yīng)結(jié)束后，取出芯片，將芯片放入生物芯片識(shí)讀儀中用基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析。④基因亞型的判斷：限制性?xún)?nèi)切酶將C677T 198bp PCR產(chǎn)物酶切后，野生型677CC有198bp片段，雜合突變型677CT有2個(gè)基因片段：198bp和175bp，純合突變型677TT產(chǎn)生175bp片段。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用表示，整體比較采用方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)方法。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。血清Hcy水平、MTHFR基因多態(tài)性與CVSD認(rèn)知功能障礙相關(guān)性用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 一般資料 研究共納入130例患者，其中男性87例（66．9%）。認(rèn)知功能正常組63例，輕度認(rèn)識(shí)功能障礙組35例，癡呆組32例。3組CSVD患者在年齡、性別、受教育年限、婚姻狀況等基線資料方面的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。3組血清Hcy水平整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0．001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，癡呆組患者血清Hcy水平高于輕度認(rèn)知功能障礙組（P＜0．001）和認(rèn)知功能正常組（P＜0．001），輕度認(rèn)知功能障礙組Hcy水平高于認(rèn)知功能正常組（P＜0．001）。

表1 3組腦小血管病患者基線資料的比較

2．2 血清同型半胱氨酸與認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性 Pearson相關(guān)檢驗(yàn)顯示血清Hcy水平與認(rèn)知功能障礙正相關(guān)（r=0．626，P＜0．001）。

2．3MTHFRC677T基因多態(tài)性與認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性 對(duì)認(rèn)知功能正常組、輕度認(rèn)知功能障礙組和癡呆組患者基因型進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3組基因型分布不同（χ2=19．265，P=0．001）。3組間基因型進(jìn)行相關(guān)分析，MTHFR677 C→T基因突變與CSVD患者認(rèn)知功能下降程度正相關(guān)（r=0．359，P=0．001）（表2）。

對(duì)3組患者M(jìn)THFRC677T等位基因進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能正常組、輕度認(rèn)知功能障礙組和癡呆組C等位基因頻率分別為72．2%、48．6%、40．6%，T等位基因頻率分別為27．7%、51．4%、59．3%；C等位基因與T等位基因在整體中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23．103，P＜0．001）。3組患者等位基因進(jìn)行相關(guān)性比較，T等位基因頻率與CSVD患者認(rèn)知功能障礙弱正相關(guān)（r=0．273，P＜0．001）。

3 討論

CSVD是指顱內(nèi)小靜脈、小動(dòng)脈、毛細(xì)血管、微動(dòng)脈等小血管病變導(dǎo)致的疾病，為涉及臨床、病理及神經(jīng)影像學(xué)改變的一系列綜合征，與卒中及認(rèn)知功能下降的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[8]。CSVD的診斷主要依靠結(jié)構(gòu)性MRI技術(shù)，其典型影像學(xué)特征包括腦白質(zhì)高信號(hào)、腦微出血、血管周?chē)g隙、新發(fā)的小的皮質(zhì)下腔隙性梗死等[9]。年齡、性別、吸煙、高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病等都被證實(shí)是CSVD的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)HHcy主要影響顱內(nèi)小血管，是CSVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。Hcy作為蛋氨酸及半胱氨酸代謝重要的中間產(chǎn)物，其可能造成血管損傷的機(jī)制包括：首先，Hcy可能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2的過(guò)度表達(dá)，而后者可以通過(guò)損傷血管基質(zhì)而破壞血腦屏障[11-12]；其次，Hcy可誘導(dǎo)活性氧自由基、二甲基精氨酸等物質(zhì)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的分泌，從而進(jìn)一步損傷內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，引起血管壁重構(gòu)等一系列改變，最終導(dǎo)致腦深部白質(zhì)和基底節(jié)區(qū)核團(tuán)缺血[13-14]。這一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致了CSVD的發(fā)生及發(fā)展。

表2 3組MTHFR基因多態(tài)性的比較

CSVD可導(dǎo)致以執(zhí)行功能、語(yǔ)言、視空間能力、信息處理速度為主的認(rèn)知功能的下降，且認(rèn)知功能障礙程度與CSVD評(píng)分正相關(guān)[15]。作為CSVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，已有大量研究證明，HHcy與CSVD的認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)，HHcy可引起CSVD各亞型患者認(rèn)知功能的下降[16]。有大型隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，HHcy與認(rèn)知功能下降程度正相關(guān)[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，HHcy可引起全腦、海馬及皮層等部位體積縮小，從而認(rèn)為腦萎縮可能是HHcy導(dǎo)致認(rèn)知功能下降的中間因素。研究者認(rèn)為，一方面HHcy通過(guò)氧化應(yīng)激等作用使腦小血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化而引起腦白質(zhì)變性或隱匿性無(wú)癥狀性腦梗死[19]；另一方面HHcy會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)鈣離子超載及大量氧自由基生成等，引起tau蛋白過(guò)度磷酸化，使得β-淀粉樣蛋白沉積，進(jìn)一步加速神經(jīng)元的凋亡，而這兩者均是認(rèn)知障礙發(fā)生的重要原因[20]。

MTHFR是Hcy代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，可以維持生物體內(nèi)Hcy的正常水平。MTHFR677 C→T基因突變可以導(dǎo)致HHcy[21]，當(dāng)發(fā)生突變時(shí)，MTHFR基因第677位點(diǎn)上胸腺嘧啶（T）取代胞嘧啶（C），導(dǎo)致該基因所編碼的丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸，這一改變降低了MTHFR的活性，酶活性的降低導(dǎo)致了Hcy濃度的升高，最終引起了腦血管病及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[22]。基于此，MTHFRC677T基因多態(tài)性與CSVD的相關(guān)性得到了廣泛關(guān)注與研究。有研究者對(duì)多項(xiàng)大型實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行了匯總分析，證實(shí)MTHFRC677T基因多態(tài)性與CSVD發(fā)病密切相關(guān)，且證明TT基因型是CSVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[23]。

本研究顯示，CSVD患者中輕度認(rèn)知功能障礙組與癡呆組患者M(jìn)THFRC677T基因突變（TT）基因型和T等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組，提示MTHFR677基因C→T突變可能是CSVD患者認(rèn)知功能損害的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步分析顯示T等位基因頻率與認(rèn)知功能損害程度正相關(guān)，提示MTHFRC677T的T等位基因可能是CSVD患者認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素。同時(shí)，癡呆組患者Hcy水平顯著高于輕度認(rèn)知功能障礙組及認(rèn)知功能正常組，與之前的研究結(jié)果是一致的。

既往研究證實(shí)，維生素B12及葉酸缺乏可以加重HHcy對(duì)認(rèn)知功能障礙的損害，所以早期發(fā)現(xiàn)和用藥可以預(yù)防及減輕其對(duì)認(rèn)知功能障礙的影響。但由于Hcy水平受高血壓、年齡等多種因素影響，所以結(jié)果準(zhǔn)確性有一定程度的誤差。而本研究中的MTHFRC677T基因水平測(cè)定可以避免混雜因素的影響，準(zhǔn)確度及靈敏度更高。能更好地預(yù)測(cè)認(rèn)知功能損害的易發(fā)人群，給予早期干預(yù)，或可預(yù)防認(rèn)知功能障礙的發(fā)生及進(jìn)展。但本研究未對(duì)CSVD各影像學(xué)亞型進(jìn)行詳細(xì)分類(lèi)，因此對(duì)于各亞型與MTHFRC677T基因多態(tài)性的相關(guān)性未進(jìn)行深入研究，有待在以后的臨床工作中進(jìn)一步探討。