外周血DNT細胞在自身免疫性疾病中的表達及意義

江濤 陳琳 王雪野

【摘要】 目的 研究外周血雙陰（double positive， DN）T細胞在自身免疫性疾病患者的分布特點， 以及自身免疫性疾病患者經過免疫治療后DNT細胞的變化情況。方法 選擇首次確診未經治療的38例自身免疫性疾病患者作為治療前組， 經過激素和或激素聯合免疫抑制劑治療后滿4周的13例自身免疫性疾病患者作為治療后組， 同期30例健康體檢者作為對照組。利用流式細胞術檢測三組研究對象的外周血DNT細胞含量， 比較三組研究對象外周血DNT細胞含量。結果 治療前組患者外周血DNT細胞含量為（4.93±2.78）%， 高于對照組的（3.90±1.90）%， 但差異無統計學意義（P>0.05）;治療后組患者外周血DNT細胞含量為（2.20±0.80）%， 低于治療前組的（4.93±2.78）%， 差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 自

身免疫性疾病患者外周血DNT細胞含量高于健康人群， 說明DNT細胞有免疫促進作用， 自身免疫性疾病患者經過免疫治療后DNT細胞較治療前明顯下降， 說明DNT細胞參與下調免疫反應的作用。

【關鍵詞】 自身免疫性疾病;雙陰T 細胞

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.33.110

Expression and significance of peripheral blood DNT cells in autoimmune diseases ? JIANG Tao， CHEN Lin， WANG Xue-ye， et al. Jilin Peoples Hospital， Changchun 130021， China

【Abstract】 Objective ? To study the distribution characteristics of double negative （DN） T cells in peripheral blood in patients with autoimmune diseases and the changes of DNT cells in patients with autoimmune diseases after immunotherapy. Methods ? There were 38 patients with autoimmune diseases diagnosed for the first time without treatment selected as the pre-treatment group， 13 patients with autoimmune diseases after 4 weeks of treatment with hormone or hormone combined immunosuppressant selected as the post-treatment group， and 30 healthy persons in the same period as the control group. Flow cytometry was used to detect the content of DNT cells in the peripheral blood of the three groups， and the content of DNT cells in the peripheral blood of the three groups was compared. Results ? The content of DNT cells in the peripheral blood in pre-treatment group was （4.93±2.78）%， which was higher than （3.90±1.90）% in the control group， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. The content of DNT cells in the peripheral blood in post-treatment group was （2.20±0.80）%， which was lower than （4.93±2.78）% in pre-treatment group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ? The content of DNT cells in the peripheral blood of the patients with autoimmune diseases is higher than that of the healthy people， which indicates that DNT cells have immune promoting effect. After immunotherapy， DNT cells in the patients with autoimmune diseases are significantly lower than that before treatment， which indicates that DNT cells participate in the down-regulation of immune response.

【Key words】 Autoimmune diseases; Double negative T cell

近期研究發現， 機體內存在著一種T細胞亞群， 這種亞群不同以往的CD4+和CD8+T細胞的， 這類細胞命名為CD3+CD4-CD8-T細胞， 即DNT細胞。經實驗證明DNT細胞存在于健康人群體內， 以及正常小鼠體內[1-4]。DNT細胞與免疫調節、自身免疫性疾病、器官移植排斥反應及腫瘤免疫耐受密切相關[5， 6]。其中自身免疫性疾病是指機體針對自身抗原而發生的免疫反應， 從而使自身組織發生了損害的一種疾病。包括系統性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕性關節炎（RA）、干燥綜合征（SS）、強直性脊柱炎（AS）、白塞氏病（BD）等。在我國王紅霞等[8]做了關于24例RA患者外周血DNT細胞的檢測， 同時也對DNT細胞表面的 FAS受體相關表達做了研究， 結果表明DNT細胞以及其表面的FAS受體表達明顯增加， 提示RA的發病機制中DNT細胞起到一定作用。SLE患者外周血中DNT細胞有著明顯的升高[7]， 甚至在SLE患者炎癥器官受累中， 產生了大量白細胞介素-17（IL-17）， 與SLE的發病被認為相關。袁偉等[9]檢測了AS患者外周血DNT細胞水平明顯高于健康人群的對照組， 提示AS患者體內發生了細胞免疫紊亂， AS的發生發展與T細胞亞群的失衡可能有關。本研究通過流式細胞術對自身免疫系統疾病患者首次確診（治療前）和治療后及健康人進行了外周血DNT細胞進行了檢測， 旨在探討DNT在自身免疫性疾病中的表達與意義。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取吉林省人民醫院風濕免疫科2014年

1月～2016年8月收治的51例自身免疫性疾病患者作為疾病組， 所有入選的患者均符合最新的分類標準。其中RA 10例，

SLE 8例， AS 13例， BD 3例， SS 2例， 銀屑病關節炎4例， 結締組織病4例， 其他自身免疫性疾病7例;其中男19例， 女32例;年齡22～65歲， 中位年齡43.2歲;其中51例患者包括首次確診未經治療的38例自身免疫性疾病患者作為治療前組， 經過激素和或激素聯合免疫抑制劑治療后滿4周的13例自身免疫性疾病患者作為治療后組。選擇同期健康體檢者30例作為對照組， 其中男13例， 女17例;年齡20～64歲， 中位年齡40.5歲。

1. 2 試劑和儀器 抗-CD3單抗、抗-CD28單抗均購自美國ebioscience公司;重組人白細胞介素（rhIL）-2、rhIL-4購自美國PEPRPTECH公司;RosettesepCD4、負選試劑盒， Easysep CD4、CD8、CD56正選試劑盒。淋巴細胞分離液購自達科為生物技術有限公司;CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE， CD3-FITC/CD56-PE， 購自法國貝克曼公司;流式細胞儀購自法國貝克曼公司。

1. 3 檢測方法 檢測外周血DNT：抽取清晨空腹患者和對照組健康人靜脈血2 ml， EDTA-K2抗凝， 標本在6 h內處理。按照檢測要求， 分別向編好的流式試管中加入20 μl單克隆抗體， 隨后加入混勻的100 μl抗凝血， 混勻， 避光， 室溫孵育15 min， 分別加入溶血劑， 溶解未標記細胞及紅細胞。應用流式細胞儀， 檢測外周血CD3+CD4-CD8-， 嚴格按照說明書操作。

1. 4 觀察指標 比較三組研究對象外周血DNT細胞含量。

1. 5 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數 ± 標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

治療前組患者外周血DNT細胞含量高于對照組， 但差異無統計學意義（P>0.05）;治療后組患者外周血DNT細胞含量低于治療前組， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1， 圖1， 圖2。

3 討論

DNT細胞是T細胞的一種亞型細胞， 隨著人們對DNT細胞的深入研究， 很多人關注到了DNT細胞介導的免疫反應， 有報道顯示， 在SLE和RA等自身免疫性疾病中調節性T細胞的免疫調節起了非常重要的作用[11， 12]。

Crispin等[13]的研究發現SLE患者外周血中DNT細胞顯著升高， 并發現在狼瘡性腎炎（LN）的腎組織中DNT細胞明顯積聚， 而且還分泌了IL-17， 然而外周血中的DNT則分泌的是γ-干擾素（IFN-γ）， 這兩種細胞因子都參與了SLE患者腎臟炎癥的發生發展。Zhang等[14]也發現了高表達IL-23R

與IL-17的DNT細胞在SLE的鼠模型中， 并且發現這個濃度與疾病的嚴重程度有正相關性。Kyttaris等[15]用IL-23R處理小鼠淋巴結的淋巴細胞給缺陷小鼠輸注了這種DNT細胞后， 引發了小鼠狼瘡樣腎炎發生。免疫細胞比例失衡在自身免疫疾病的發病機制中起著重要作用， 為將來自身免疫性疾病應用生物治療提供了非常重要的理論基礎[16]。本實驗研究治療前組患者外周血DNT細胞含量為（4.93±2.78）%， 高于對照組的（3.90±1.90）%， 但差異無統計學意義（P>0.05）;說明自身免疫性疾病患者外周血DNT細胞含量升高， 與對照組雖然無差異， 但說明DNT細胞有免疫反應促進作用。且本次實驗顯示：治療后組患者外周血DNT細胞含量為（2.20±

0.80）%， 低于治療前組的（4.93±2.78）%， 差異具有統計學意義（P<0.05）， 說明DNT具有下調免疫反應。

本實驗證實， 與健康對照組相比， 自身免疫性疾病患者中DNT細胞含量升高， 但差異無統計學意義， 可能與疾病的病種多樣性有關， 各個免疫疾病的發病機制不盡相同， 故在今后研究中需要進一步細化自身免疫性疾病的病種， 可能會帶來更有價值的結論。

隨著人們對DNT細胞研究的進一步深入研究， 對DNT細胞的了解和認識也將越來越豐富， 應進一步研究在不同疾病在發病、進展及轉歸過程中， 相關的基因突變及細胞因子的表達， 還有對藥物反應等方面的變化情況， 以期深入推動更多疾病的免疫治療以造?；颊撸?造福人類。

綜上所述， 自身免疫性疾病患者外周血DNT細胞含量高于健康人群， 說明DNT細胞有免疫促進作用， 自身免疫性疾病患者經過免疫治療后DNT細胞較治療前明顯下降， 說明DNT細胞參與下調免疫反應的作用。

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[收稿日期：2019-06-06]