調環酸鈣在馬鈴薯及植株中的殘留和消解分析

董見南，李雪茹，陳國峰，劉 峰，張曉波，廖 輝

（黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

調環酸鈣（Prohexadione-calcium）化學名稱為3,5-二氧代-4-丙酰基環己烷羧酸鈣，是由日本組合化學工業公司（Kumiai Chemical Industry Co.,Ltd.）合成開發的植物生長調節劑。其常見用于禾谷科作物，能有效地抑制作物節端生長，縮短莖稈長度，使莖稈粗壯、植株矮化抗倒伏[1,2]，也有報道用于花生[3]和煙草[4]，目前馬鈴薯也開始開發使用調環酸鈣用作植物生長調節劑。關于調環酸鈣的研究主要集中在合成[5,6]、制劑研制[7]、制劑含量分析[8,9]及生產應用研究[1,4]，殘留分析方面的報道主要集中在糙米中分析方法研究及檢測結果[10]方面。雖然調環酸鈣屬低毒低殘留農藥[1]，但其原藥有胎鼠致畸毒性的報道[11]，因此調環酸鈣在農作物中的殘留量應引起人們的重視。本文建立了馬鈴薯及馬鈴薯植株中調環酸鈣的分析方法，并應用于田間樣品的分析，為指導農藥的合理安全使用及制定中國調環酸鈣在馬鈴薯上的最大殘留限量提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試 劑

調環酸鈣（92.0%）標準品由Dr. Ehrenstorfer GmbH公司提供，乙腈（色譜純，迪馬公司），甲醇（色譜純，迪馬公司），甲酸（色譜純，迪馬公司），無水Na2SO4（分析純，北京化學試劑公司），N-丙基乙二胺（Primary secondary amine，PSA，40-60 μm，博納艾杰爾公司），弗羅里硅土（40-60目，博納艾杰爾公司）。

1.2 儀器設備

ACQUITY UPLC/TQ Detector 超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Waters 公司）；Shim-pack GISS C18（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱（日本島津公司）；BSA6202S 電子天平（德國Sartorius 公司）；HS501 振蕩器，MS3 basic 渦旋混合器（德國IKA 公司）；N-EVAP 112 氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；過濾器（濾膜孔徑0.22 μm）；常用玻璃器皿。

1.3 田間試驗

供試藥劑為8%調環酸鈣泡騰顆粒劑，推薦劑量為24～48 g/hm2（制劑用藥量300～600 g/hm2）。參照農業部《農藥殘留試驗準則》[12]，2017年在黑龍江省哈爾濱市和湖南省長沙市2地進行了消解動態和最終殘留試驗。黑龍江試驗地的馬鈴薯品種為‘尤金’，湖南試驗地的馬鈴薯品種為‘費烏瑞它’。

消解動態試驗：施藥劑量為72 g/hm2（制劑用藥量900 g/hm2）。施藥后2 h，1，2，3，5，7，10，14，21，30和45 d采集馬鈴薯植株樣品。最終殘留試驗：設2 個施藥劑量，低劑量施藥量為48 g/hm2（制劑用藥量600 g/hm2），高劑量施藥量為72 g/hm2（制劑用藥量900 g/hm2），每個處理設3 個重復小區，每小區30 m2，馬鈴薯收獲期采集馬鈴薯塊莖。施藥時期均為馬鈴薯現蕾期。另設不施藥的馬鈴薯田為對照區，于施藥前采集馬鈴薯植株空白對照樣品，于馬鈴薯收獲期采集馬鈴薯空白對照樣品。樣品采集后用自封袋密封，貼好標簽后-20 ℃以下保存。

1.4 分析方法

1.4.1 前處理

參考調環酸鈣的溶解度、解離常數及韋婕等[10]的研究結果，經優化后確立馬鈴薯及馬鈴薯植株的前處理方法。準確稱取馬鈴薯、馬鈴薯植株樣品10.0 g，加入20 mL酸化乙腈（體積分數0.2%甲酸），加蓋后振蕩提取30 min，加入10 g無水Na2SO4，渦旋1 min鹽析，然后以3 500 r/min離心5 min。

移取2 mL上清液至玻璃試管中，40 ℃水浴下N2吹干。用超純水定容至1 mL，過0.22 μm 水系濾膜，用超高效液相色譜-串聯質譜進行測定，外標法進行定性和定量分析。

1.4.2 儀器條件

色譜柱：Shim-pack GISS C18（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫35 ℃；流速0.25 mL/min；梯度洗脫（流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈）：0～1.0 min 為90%A，1.5 min 為50%A，3.0 min 為50%A，3.2 min為90%A。進樣量10 μL。電噴霧離子源ESI；正離子源模式；毛細管電壓為3.0 kV；錐孔電壓為25 V；離子源溫度為120 ℃；干燥器溫度為350 ℃；干燥器流速650 L/h；錐孔氣流量50 L/h；調環酸鈣在流動相中電離為調環酸，質譜監測對象為調環酸，多重反應監測（MRM）方式，調環酸以離子對（m/z）214.2→158.1 進行定量分析，214.2→141.0 進行定性分析。在上述色譜條件下，調環酸的保留時間為2.2 min。

1.4.3 標準工作曲線的繪制

稱取調環酸鈣標準品0.010 9 g（精確至0.000 1 g），用少量pH 2的磷酸水溶液溶解，再用超純水定容至刻度線，配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準貯備液，試驗時再用超純水逐級稀釋成質量濃度為2.0，1.0，0.5，0.1，0.05 和0.01 mg/L 的系列標準溶液。在選定的儀器條件下測定，以標準溶液濃度為橫坐標（x）、定量離子峰峰面積為縱坐標（y）繪制標準工作曲線。

1.4.4 方法的回收率和精密度

向空白馬鈴薯及馬鈴薯植株中添加調環酸鈣標準溶液，使得馬鈴薯樣品中添加質量分數為0.02，0.05，0.5 mg/kg，馬鈴薯植株樣品中添加質量分數為0.05，0.5，2.0 mg/kg。每個質量分數進行5次重復試驗，按照1.4.3方法測定，以添加回收樣品峰面積和相應進樣濃度的標準溶液峰面積相比較，計算回收率；以各質量分數的5次重復試驗的回收率計算平均回收率和相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 質譜參數優化

嘗試了超高效液相色譜法-串聯質譜法。調環酸鈣在流動相中電離為調環酸，質譜監測對象為調環酸，用電噴霧離子源分別采用正/負模式下進行全掃描（m/z 50～350），可得到3 個調環酸準分子離子峰：[M-1]峰（m/z 211.3）、[M+1]峰（m/z 213.1）和[M+2]峰（m/z 214.2），比較儀器響應值可得正離子模式響應遠高于負離子模式，選用調環酸[M+2]峰（m/z 214.2）為母離子。通過進一步優化二級質譜參數，分別選擇離子對（m/z）214.2→158.1 進行定量分析，選擇離子對（m/z）214.2→141.0進行定性分析，見圖1。

2.2 前處理方法摸索

比較了乙腈、0.2%甲酸乙腈、甲醇和0.2%甲酸甲醇4 種提取溶劑的提取效率，結果見圖2。酸化乙腈和酸化甲醇的提取效率明顯高于乙腈和甲醇，且提取率更穩定，這可能與調環酸鈣易酸解離有關。由于乙腈易與水相分離，既去除了水溶性雜質且利于后續的濃縮步驟，因此本文最終選擇使用0.2%甲酸乙腈作提取溶劑。對濃縮后的提取液，通過比較無凈化、25 mg PSA 和50 mg 弗羅里硅土的試驗結果可知，PSA 對調環酸鈣有明顯的吸附作用，弗羅里硅土的凈化效果不顯著。由于濃縮后的定容液為超純水，即可去除酸化乙腈提取液中的部分弱極性雜質，因此最終選擇超純水定容且不需要其他凈化步驟。

圖1 調環酸鈣的二級質譜圖Figure 1 Typical daughter scan chromatograms of prohexadione-calcium

圖2 4種不同提取溶劑對馬鈴薯及馬鈴薯植株中調環酸鈣的提取效率Figure 2 Extraction efficiencies of four different solvents on extraction of prohexadione-calcium from potato and potato plant

2.3 檢測方法評價

用超純水配制不同質量濃度的調環酸鈣系列標準溶液，濃度與儀器條件見1.4.2，在0.01～2.0 mg/L濃度線性良好，標準工作曲線為：y = 10 280 x +137.3，R2為0.999 6。

調環酸鈣在馬鈴薯及馬鈴薯植株中的添加回收試驗結果如表1所示，典型色譜圖如圖3所示。在馬鈴薯中的平均回收率為87.8%～99.0%，相對標準偏差（RSD）為1.7%～3.2%；在馬鈴薯植株中的平均回收率為93.9%～98.0%，RSD 為2.1%～4.8%。將最小添加濃度確定為方法的定量限（LOQ，以質量分數計，mg/kg），調環酸鈣在馬鈴薯及馬鈴薯植株中的LOQ 分別為0.02 和0.05 mg/kg。中國制定的最大殘留限量標準（GB 2763-2016）中尚無調環酸鈣在馬鈴薯中的最大殘留限量（MRL），韓國已制定調環酸鈣在馬鈴薯中的MRL值為0.2 mg/kg。結果表明所建方法的準確度、精密度及靈敏度較好，均符合農藥殘留分析試驗的要求。

表1 調環酸鈣在馬鈴薯及馬鈴薯植株中的添加回收率Table 1 Recoveries of prohexadione-calcium in potato and potato plant

圖3 調環酸鈣在馬鈴薯及馬鈴薯植株空白和基質匹配標樣的典型色譜圖Figure 3 Typical UPLC-MS/MS chromatograms of prohexadione-calcium in potato and potato plant

2.4 調環酸鈣在馬鈴薯植株中的消解動態

由圖4結果所示，調環酸鈣在馬鈴薯植株中的殘留量隨時間的延長逐漸降低，其消解過程符合一級動力學方程，經擬合后計算可知，調環酸鈣在馬鈴薯植株中的消解半衰期分別為1.4 d（黑龍江）和1.5 d（湖南），原始沉積量在0.37～0.56 mg/kg。由半衰期可知，不同試驗地域的氣候類型和作物品種等差異對調環酸鈣在馬鈴薯植株體內的消解速率影響不大，且消解迅速。

圖4 調環酸鈣在馬鈴薯植株中的消解趨勢Figure 4 Residue dissipation curves of prohexadione-calcium in potato plant

表2 調環酸鈣在馬鈴薯最終殘留樣品中的殘留量Table 2 Final residues of prohexadione-calcium in potato

2.5 調環酸鈣在馬鈴薯中的最終殘留

按照有效成分48 和72 g/hm2的劑量在馬鈴薯現蕾期施用1 次，馬鈴薯收獲時采集馬鈴薯塊莖樣本進行殘留量測定。結果表明馬鈴薯中調環酸鈣的最終殘留量均＜0.02 mg/kg（表2）。韓國制定調環酸鈣在馬鈴薯中的最大殘留限量（MRL）值為0.2 mg/kg，試驗結果表明按照此施藥方法施用，收獲馬鈴薯中調環酸鈣的殘留量在0.2 mg/kg 以下。以上數據為中國制定調環酸鈣在馬鈴薯上的MRL值提供了數據支持。

3 討 論

由于調環酸鈣的辛醇-水分配系數（KowlogP）為-2.9，解離常數（pKa）為5.15，其在水及有機溶劑中的溶解能力和酸解離現象使得目標基質中調環酸鈣的提取和濃縮成為其殘留檢測分析的難點。目前尚無調環酸鈣在馬鈴薯中提取方法的報道，本研究結合調環酸鈣的理化特性和稻米[10]中調環酸鈣檢測方法，比較了4種不同溶劑的提取效率，結果表明酸化甲醇和酸化乙腈提取效率優于甲醇和乙腈且更穩定。由于酸化乙腈對馬鈴薯基質的提取效果更佳，且乙腈更易于與水分離，本文最終選擇酸化乙腈作為提取溶劑，這與韋婕等[10]在稻米中的研究結果相一致。分析原因可能為適當的H+濃度能抑制調環酸鈣的電離，使其更容易以分子形式存在，從而更容易進入有機溶劑中易于提取。乙腈與水的混溶和鹽析特性在保證提取效率的同時簡化了凈化步驟，本研究用無水Na2SO4代替經典QuERChERS[13]方法中的NaCl，提供鹽離子的同時吸收乙腈中的微量水分，更利于后續的濃縮操作。本研究嘗試了分散固相萃取的凈化方法，對濃縮后的提取液進行了無凈化、25 mg PSA和50 mg弗羅里硅土3種試驗。結果表明PSA對調環酸鈣有強吸附作用，使用后回收率大大降低；弗羅里硅土無明顯凈化效果，使用后進樣溶液顏色無目視變化且靈敏度無明顯提高。本試驗濃縮后使用超純水定容，該換相處理有效地去除了易溶于乙腈且不易溶于水相的弱極性雜質，從而達到了凈化目的。韋婕等[10]在進行稻米中調環酸鈣的檢測時同樣將提取液濃縮后直接用超純水定容。結果表明凈化劑PSA和弗羅里硅土不適用于調環酸鈣的提取，換相定容的試驗方法能有效去除雜質。本文將超高效液相色譜-串聯質譜用于調環酸鈣的檢測，結果表明超高效液相色譜-串聯質譜能穩定的檢測調環酸鈣并表現出較高的靈敏度，相比于已報道的紫外檢測器[8-10]的檢測手段，串聯質譜擁有更強的抗干擾能力，為前處理過程中的濃縮和凈化步驟減少了壓力。然而串聯質譜靈敏度的穩定性一直是此項檢測技術的難點，且其線性范圍較窄，這些都是科研工作者今后研究探索的重點。同時開發和發現適合調環酸鈣類似結構和理化特性的凈化劑，或固相萃取方法，在分離調環酸鈣和雜質、提高檢測分析的靈敏度方面或可有更大益處。本研究建立了采用超高效液相色譜-串聯質譜聯用檢測馬鈴薯和馬鈴薯植株中調環酸鈣殘留量的方法，該方法操作簡便，準確性和靈敏度均能滿足農藥殘留檢測的要求。

消解動態試驗結果表明，調環酸鈣在黑龍江和湖南2試驗地馬鈴薯植株中的消解半衰期分別為1.4和1.5 d，試驗地氣候類型和作物品種等差異對調環酸鈣在植株中的原始沉積量和消解速率影響不大，調環酸鈣在馬鈴薯植株體內消解迅速。

最終殘留試驗結果表明，以最高推薦施藥劑量48 g/hm2和1.5倍最高推薦施藥劑量72 g/hm2在馬鈴薯現蕾期施用一次，收獲期馬鈴薯中的調環酸鈣殘留量均＜0.02 mg/kg。中國未制定調環酸鈣在馬鈴薯中的最大殘留限量，韓國規定為0.2 mg/kg，結果表明，按照推薦劑量施用調環酸鈣制劑后，收獲馬鈴薯中調環酸鈣的殘留量是安全的（相對韓國的限量標準），此試驗數據為中國制定調環酸鈣在馬鈴薯上的MRL值提供了數據支持。