馬鈴薯高支鏈淀粉突變體‘P24023’的HRM分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用

范書華，董清山*，趙團(tuán)結(jié)，解國慶，王 艷，趙云彤，時新瑞

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）淀粉包含支鏈淀粉和直鏈淀粉，馬鈴薯支鏈淀粉具有抗老化性、改善凍融平衡、高膨脹性、高吸水性及增稠作用等功能，被廣泛應(yīng)用于食品、包裝材料的制作、醫(yī)藥和建筑工業(yè)等領(lǐng)域[1]。工業(yè)生產(chǎn)上分離直鏈淀粉和支鏈淀粉工藝復(fù)雜、費時、費力[2]，因此，培育出支鏈淀粉含量更高的馬鈴薯品種具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義[3]。

通過對豌豆突變體[4]、馬鈴薯[5]及禾谷類突變體[6]的研究表明，植物體內(nèi)如果缺少GBSS 蛋白，直鏈淀粉就不能合成。劉玉匯等[7]利用RNAi 技術(shù)降低GBSS 基因轉(zhuǎn)錄水平獲得了支鏈淀粉含量比對照高10.31%～20.92%的馬鈴薯，并發(fā)現(xiàn)支鏈淀粉含量與基因沉默效率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。劉永強(qiáng)[8]通過轉(zhuǎn)基因的方法干擾GBSS 基因表達(dá)從而獲得了支鏈淀粉比例高達(dá)99.2%的馬鈴薯材料。Andersson等[9]通過基因編輯的方法獲得了馬鈴薯GBSS突變體材料‘P24023’，GBSS基因功能喪失后，馬鈴薯支鏈淀粉含量明顯升高。馬鈴薯栽培品種‘克新12號’是黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所利用自交種子選育而成的高淀粉品種[10]，具有高產(chǎn)、抗病、淀粉含量高的優(yōu)點，已經(jīng)在全國多地推廣[11]。‘克新12號’屬加工型品種，總淀粉含量為16.5%，直鏈淀粉占24.7%，支鏈淀粉占總淀粉比例為75.3%左右[12]。為了培育更適合加工生產(chǎn)支鏈淀粉的馬鈴薯種質(zhì)，本課題組通過有性雜交的方法把高支鏈淀粉基因gbss由‘P24023’導(dǎo)入到‘克新12號’。

高分辨率熔解曲線（High resolution melting，HRM）是近些年發(fā)展起來的新技術(shù)，該技術(shù)可以分辨單個堿基的基因突變，具有靈敏度高，成本低，操作簡便的特點，已在水稻、玉米等作物上廣泛應(yīng)用[13]。本研究針對gbss 基因的功能性變異位點，將其開發(fā)為HRM分子標(biāo)記，為進(jìn)一步將gbss基因?qū)氲礁嗟倪m合本地栽培的馬鈴薯品種中，創(chuàng)制更多高支鏈淀粉馬鈴薯品種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中所用馬鈴薯突變體材料‘P24023’由瑞士農(nóng)業(yè)科學(xué)大學(xué)Hofvander教授饋贈，支鏈淀粉含量占總淀粉含量比例為99.5%；其余11份馬鈴薯材料由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院收集保存（表1）。這12份馬鈴薯材料用于GBSS基因突變位點多態(tài)性檢測。

為了培育適合本地種植的高支鏈淀粉馬鈴薯品種，以‘P24023’突變體為供體，利用gbss 基因改良‘克新12號’。以‘克新12號’為母本和‘P24023’為父本，通過去雄雜交，得到雜交F1代實生種子，F(xiàn)1代自交結(jié)實得到F2代實生種子。由于12份馬鈴薯材料中有11份材料GBSS基因的突變區(qū)域沒有多態(tài)性，為控制試驗規(guī)模，挑選6個當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主栽品種，‘克新12號’、‘尤金’、‘早大白’、‘東農(nóng)303’、‘大西洋’、‘夏波蒂’和高支鏈淀粉突變體材料‘P24023’以及‘克新12號’和‘P24023’的F2代群體用于分子標(biāo)記功能分析。每個單株取健康葉片用于提取基因組DNA。

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1.2 引物設(shè)計及信息

根據(jù)‘P24023’突變體中的GBSS 基因序列設(shè)計HRM引物gbss-F/gbss-R（gbss-F：5'-tctctataca ggtcatggacgc-3'，gbss-R：5'-cctcaagtctgccgatgaa gcc-3'），引物由深圳華大基因公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增以及HRM檢測

依據(jù)劉玉匯等[7]的方法提取馬鈴薯葉片基因組DNA。PCR 反應(yīng)體系如下：10 ng 基因組DNA，Buffer（Mg2+plus），250 μmol/L dNTPs，0.1 μmol/L gbss-F/gbss-R 引 物， 0.5 U rTaq DNA 聚 合 酶（TaKaRa，Japan）和0.1 μL 20×EvaGreen 熒光染料（Biotium USA），加ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。PCR 擴(kuò)增程序如下：94 ℃4 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃10 s，39 個循環(huán)；72 ℃1 min；95 ℃1 min；25 ℃1 min。PCR結(jié)束后，每個反應(yīng)體系中加入1 μL溫度內(nèi)參，2 500 r/min 離心1 min 后即可進(jìn)行高分辨率熔解曲線采集及分型，后續(xù)具體操作參考金名捺等[13]的方法。

表1 12份用于GBSS多態(tài)性分析的馬鈴薯品種Table 1 Twelve potato varieties used for polymorphism analysis of GBSS

PCR產(chǎn)物同時送到華大基因進(jìn)行DNA測序，確定不同馬鈴薯材料的基因類型；序列比對使用Lasergene軟件。

1.4 淀粉含量測定

采用水沉淀法[14]制備馬鈴薯塊莖淀粉，采用雙波長法分別測定支鏈淀粉和直鏈淀粉含量，兩者和為總淀粉含量，計算支鏈淀粉占淀粉的百分率。測定直鏈淀粉含量采用的波長分別為λ1=500 nm，λ2= 600 nm；測定支鏈淀粉采用的波長分別為λ3=700 nm，λ4=590 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 GBSS功能基因特異性分子標(biāo)記開發(fā)

為了給高支鏈淀粉馬鈴薯育種提供快速檢測的分子標(biāo)記，本研究在‘P24023’突變體的GBSS基因突變位點兩側(cè)設(shè)計了gbss-F/gbss-R 引物，分別以12份馬鈴薯葉片基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增特異性好，片段大小也與預(yù)測的一致（圖1）。

通過對12份馬鈴薯材料（表1）的基因組進(jìn)行擴(kuò)增、測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，除‘P24023’外，其他11份材料在GBSS基因突變區(qū)域均沒有多態(tài)性（圖2）。

2.2 gbss基因功能分子標(biāo)記的驗證

由于12份馬鈴薯材料中有11份材料GBSS基因的突變區(qū)域沒有多態(tài)性，選擇了6份栽培品種‘克新12號’、‘尤金’、‘早大白’、‘東農(nóng)303’、‘大西洋’、‘夏波蒂’和帶有g(shù)bss 突變的‘P24023’以及‘P24023’ב克新12號’的雜交F2代群體用于標(biāo)記的功能驗證。種植F2代實生種子共得到單株208 株，利用gbss-F/gbss-R引物對上述馬鈴薯育種材料進(jìn)行HRM 分型檢測，結(jié)果被檢測群體被分為3 種類型（圖3）。一種是與‘P24023’分為一類的峰圖（長實線）共6 株，除‘P24023’外，有5 株F2代單株，簡稱‘P群’；一種是與普通栽培品種分為的峰圖（空心曲線）共10株，除6個栽培品種外，有4株F2代單株，簡稱‘K群’；而F2代群體中絕大多數(shù)被分為第三類（實心連續(xù)曲線），共199株，簡稱‘F2雜群’。每份材料做3次重復(fù)，每次結(jié)果都一致，證明該標(biāo)記具有很好的穩(wěn)定性。

圖1 引物gbss-F和gbss-R對馬鈴薯基因組DNA的擴(kuò)增效果檢測Figure 1 Detection of amplification effects of primers gbss-F and gbss-R for potato genomic DNA

2.3 淀粉含量測定

根據(jù)HRM 分型結(jié)果，每種群體（P 群、F2雜群和K群）植株分別挑選4個單株，對應(yīng)植株所結(jié)塊莖用于淀粉含量測定。結(jié)果顯示P群植株塊莖支鏈淀粉占總淀粉比例為99.1%，與‘P24023’相當(dāng)；K群植株的塊莖支鏈淀粉占總淀粉比例為75.5%，與‘克新12號’支鏈淀粉比例相同；而F2雜群植株的塊莖支鏈淀粉占總淀粉比例為80.5%（圖4）。說明通過雜交轉(zhuǎn)育gbss基因可以使塊莖中的支鏈淀粉含量占總淀粉的比例顯著上升。

以上結(jié)果表明，HRM能夠?qū)︸R鈴薯支鏈淀粉基因的改良過程進(jìn)行很好的跟蹤。因此，gbss-F/gbss-R可以作為鑒定和檢測高支鏈淀粉基因gbss的特異性功能分子標(biāo)記，為馬鈴薯種質(zhì)資源的創(chuàng)制和分子標(biāo)記輔助改良提供技術(shù)支持。

圖2 12份馬鈴薯材料GBSS基因位點擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果比對分析Figure 2 Sequence analysis of amplified products of GBSS locus from 12 potato materials

圖3 引物gbss-F和gbss-R對馬鈴薯群體的HRM分型效果Figure 3 HRM genotyping results of potato populations by gbss-F/gbss-R primer sets

圖4 馬鈴薯支鏈淀粉含量測定Figure 4 Amylopectin content of different potato tubers

3 討 論

馬鈴薯是黑龍江省重要作物[15]，除作為食物外，大部分用于工業(yè)生產(chǎn)淀粉原料使用。馬鈴薯淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉，由于性質(zhì)不同，工業(yè)上需要把兩種淀粉分別純化。如果農(nóng)業(yè)生產(chǎn)出的馬鈴薯只含有一種淀粉，就省去淀粉分離成本。關(guān)于直鏈淀粉的合成關(guān)鍵基因已有深入的研究，通過反義或干涉表達(dá)GBSS基因可以得到高支鏈淀粉含量馬鈴薯[4-6]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子輔助育種得到越來越多的應(yīng)用，分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確跟蹤一些重要的作物性狀，而不受環(huán)境影響。目前馬鈴薯的分子標(biāo)記主要是采用DNA電泳的方法進(jìn)行[16]，該方法存在費時、費力、高成本、低效率等缺陷；改進(jìn)后的小片段HRM方法是一種準(zhǔn)確、高效、低成本的突變位點檢測方法，高度靈敏性以及優(yōu)良的準(zhǔn)確性使得HRM方法在作物分子標(biāo)記育種上具有巨大的應(yīng)用潛力。栽培馬鈴薯是四倍體作物，四倍體基因組雜合度較高，其基因型研究相對二倍體復(fù)雜，其F2代分離單株應(yīng)該有多種基因型。本研究所開發(fā)的標(biāo)記將雜交群體后代分為3種類型（圖3），是因為‘F2雜類’的199 株單株應(yīng)該包括了除親本類型的多種基因型，所以單株間高分辨率熔解曲線有些差別（圖3），具體有哪些基因型還需進(jìn)一步實驗驗證。

本研究基于GBSS基因突變位點設(shè)計的HRM標(biāo)記分型檢測方法能夠高效、準(zhǔn)確地進(jìn)行高支鏈淀粉馬鈴薯資源的鑒定及改良后代群體的高通量篩選檢測。本研究創(chuàng)制的高支鏈淀粉馬鈴薯新種質(zhì)，總淀粉含量跟‘克新12號’相當(dāng)，但支鏈淀粉含量大幅度升高，為將來生產(chǎn)上提供更適合加工的馬鈴薯品種提供了優(yōu)質(zhì)資源。