不同煙葉醇化倉庫的倉間空氣霉菌組成差異分析

姜振錕 劉景川 陳善義 李菁菁 何偉 張增基 沈祿恒

摘 要：為明確片煙醇化倉庫倉間空氣中含有的霉菌種類和組成，以龍巖煙草工業有限責任公司東肖煙葉庫3個倉庫為研究對象，采用空氣微生物采樣器進行浮游霉菌采樣，所得的霉菌平板經28℃下培養4d后計數，挑取菌落并進行ITS測序，分析不同煙葉醇化倉庫的倉間空氣浮游霉菌的組成差異。結果表明，相對濕度大的倉庫，其倉間空氣中含有的霉菌數量多;3個倉庫倉間空氣中收集獲得的霉菌共有15個種，含量占比在25%以上的霉菌為極細枝孢、枝狀枝孢菌和桔青霉;極細枝孢為4號庫的優勢霉菌，而枝狀枝孢菌為9號庫、13號庫的優勢霉菌。

關鍵詞：霉菌;微生物區系;片煙;倉儲養護

中圖分類號 S572文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）22-0040-02

在卷煙生產加工過程中，復烤后的片煙倉儲醇化是一個重要環節。片煙自然醇化周期較長，通常為12～30個月[1-3]?？諝庵写嬖谥喾N霉菌，片煙在倉儲過程易沾染霉菌孢子，由于煙葉中含有霉菌生長所需的蛋白質、還原糖等多種營養物質，再加上煙葉本身吸濕性強，一旦條件適宜，易發生霉變[4]，嚴重影響煙葉的使用價值。有關片煙霉變微生物的區系研究，目前主要集中在片煙本身含有的霉菌，而對于倉儲醇化過程中倉間空氣霉菌的研究甚少。為此，本研究以龍巖煙草工業有限責任公司煙葉倉庫為試驗對象，利用空氣微生物采樣器采集倉庫倉間空氣霉菌孢子，分析不同倉庫空氣霉菌的組成差異，旨在為片煙霉變的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養基：購于廣東環凱微生物科技有限公司（貨號021115），按廠家說明書配制，121℃下滅菌15min后，冷卻至約65℃時，向培養基中加入硫酸鏈霉素（終濃度為50μg/mL）。改良馬丁瓊脂培養基：購于廣東環凱微生物科技有限公司（貨號021041），按廠家說明書配制，121℃下滅菌15min。儀器：空氣微生物采樣器（MAS-100NT型，Millipore公司，瑞士）、恒溫恒濕培養箱（CLC-B2V-M/CLC 222-TV型，MMM Group公司，德國）。

1.2 方法 采樣地點位于龍巖煙草工業有限責任公司東肖煙葉倉庫4號（2001年建成，密封條件較差）、9號（2008年建成，密封條件較好）、13號（2010年建成，密封條件中等）醇化庫，所選樓層均為3樓（3個倉庫總樓層數均為5層）。以DG18培養基為霉菌收集培養基，利用MAS-100NT空氣采樣器進行倉間空氣霉菌采樣，采樣體積為100L，每個倉庫重復3次。采樣時，利用手持式溫濕度儀測量并記錄倉間空氣的溫濕度。采樣結束后，蓋上培養皿蓋，所得微生物平板帶回實驗室，于28℃下培養4d后，統計每個培養皿上長出的菌落數。挑取菌落形態及顏色差異較大的菌落，轉移至改良馬丁瓊脂培養基，于28℃培養4d。重復上述傳代過程，直至長出的菌落形態單一，以實現菌落的純化。純化好的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行ITS測序，所得序列于GenBank數據庫中進行BLAST比對。用MEGA X軟件[5]自帶的Clustal W模塊對所得霉菌ITS序列進行多重比對。然后通過MEGA X軟件中的Maximum Composite Likelihood模型計算進化距離，利用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，Bootstrap重復次數設置為1000次。

2 結果與分析

2.1 不同煙葉醇化倉庫的霉菌數量 由表1可知，就溫度而言，采樣時3個倉庫空氣溫度差異不大。相對濕度方面，4號庫最大、9號庫最小、13號庫居中。相應地，4號庫平均的霉菌含量最大、9號庫最小、13號庫居中。3個倉庫霉菌含量彼此之間差異顯著，且4號庫與其余2個倉庫差異達到極顯著水平。這說明倉間空氣中霉菌的含量與空氣相對濕度關系密切。

2.2 不同煙葉醇化倉庫的霉菌組成差異 由表2～4可知，4號庫倉間空氣含有6種霉菌，分別為極細枝孢、Cladosporium xanthochromaticum、菌核青霉菌、擬粉紅鎖擲孢酵母、裂褶菌以及小孢擬盤多毛孢，其中極細枝孢為優勢菌，占比為83.58%;9號庫倉間空氣含有5種霉菌，分別為枝狀枝孢菌、短密青霉菌、裂褶菌、小孢擬盤多毛孢以及Penicillium virgatum，其中枝狀枝孢菌為優勢菌，占比為81.40%;13號庫倉間空氣含有4種霉菌，分別為枝狀枝孢菌、桔青霉、頂青霉及鮮紅青霉，其中枝狀枝孢菌為優勢菌，占比為66.67%。此外，4號、9號庫共同含有的霉菌種類為裂褶菌和小孢擬盤多毛孢，9號、13號庫共同含有的霉菌為枝狀枝孢菌。

2.3 東肖煙葉倉庫倉間空氣中霉菌的系統進化樹分析 由圖1可知，3個倉庫倉間空氣分離所得菌株共有15個種。所得的15種霉菌在系統進化樹上形成2大分支，其中4號庫的DX4-5菌株獨立形成1個大的分支，其余14種霉菌另形成1個大的分支，說明DX4-5菌株與其余14個種菌株的親緣關系較遠。

3 結論與討論

對比3個倉庫的溫濕度條件和霉菌數量可以得知，倉庫條件和倉間環境的濕度對倉間空氣霉菌數量的影響較大。倉庫條件好、濕度較低的情況下，空氣中的霉菌數量明顯少于倉庫條件差、濕度較高的倉庫。因此，控制倉庫的環境濕度可有效減少空氣中霉菌的數量，進而降低倉儲片煙霉變的風險。ITS測序及BLAST比對結果表明，極細枝孢、枝狀枝孢菌和桔青霉為相對的優勢霉菌，不同倉庫的倉間空氣霉菌組成有所差異。下一步應開展上述優勢霉菌的生物學特性及致霉條件的研究，以期為倉儲片煙的霉變控制提供科學依據。

參考文獻

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[5]Kumar S.， Stecher G.， Li M.， et al. MEGA X：Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms [J].Molecular Biology and Evolution， 2018， 35（6）：1547-1549.

（責編：張宏民）

基金項目：福建中煙工業有限責任公司科技項目（FJZYKJJH2018011）。

作者簡介：姜振錕（1994—），男，福建永定人，助理工程師，從事煙草原料研究工作。劉景川（1988—），男，福建龍巖人，助理農藝師，從事煙草原料研究工作。#共同第一作者 *通訊作者? 收稿日期：2019-09-23