氫氣聯合自然殺傷細胞對肺癌細胞生長的影響

夏盛全 任濤 王凱玲 顧霞

同濟大學附屬東方醫院呼吸內科,上海200123

氫氣作為一種新型抗氧化劑,近年來受到越來越多的學者關注。它通過多種作用方式保護機體,在缺血再灌注損傷、神經系統損傷、電離輻射損傷、代謝綜合征等疾病方面有著顯著的預防和治療作用[1]。自然殺傷 (natural killer,NK)細胞是構成機體免疫系統的重要成員,其不需要抗原預先致敏,不依賴抗體與補體,也無組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性,能快速、直接殺傷腫瘤細胞,是機體腫瘤免疫中的第一道防線[2]。本研究通過氫氣對非小細胞肺癌患者NK 細胞的增殖能力作用、殺瘤能力作用的研究,探討氫氣對非小細胞肺癌患者NK 細胞功能的影響,為今后的臨床研究提供新思路,指導臨床應用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 四甲基偶氮唑藍 (methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 (碧云天,C0009),酶標檢測儀(Thermo MK3 型),PI(碧云天C1052),細胞培養箱 (Thermo Scientific 8000),光學顯微鏡(XDS-1A),倒置拍照顯微鏡 (Leica DMI3000B),低速離心機 (上海盧湘儀TDZ4B-WS),FACs CaliburTM流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司,雙色熒光標記抗CD 分子單克隆抗體CD3-FITC/CD16+56+PE購自美國BD Bioscience公司。干擾素γ (interferon-γ,IFN-γ)試劑盒、IL-4試劑盒 (Elabscience),Matrigel BD Incorporated,USA,Transwell plate：Costar,Coring Incorporated,USA,氫氣機(江蘇無錫恒源生物)。

1.2 NK 細胞的分離與培養 抽取非小細胞肺癌患者外周血50 ml,用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC),計數后在含有IL-2、血清等的培養基及刺激因子包被的75 cm2培養瓶中進行培養擴增。第3～4天將細胞移入175 cm2培養瓶中,并補充新的培養基繼續培養。第7～8天將細胞移入培養袋中,補充新的培養基繼續培養,細胞置于37℃、5%CO2孵育箱中培養。第12～14天后取少許培養的NK 細胞用流式細胞儀進行檢測,讀出CD3-/CD16+CD56+的百分比。

1.3 氫氣對NK 細胞增殖能力的作用 實驗分為對照組：NK 細胞;實驗組：NK 細胞+20%氫氣組(20%氫氣組)、NK 細胞+40%氫氣組 (40%氫氣組)、NK 細胞+60%氫氣組(60%氫氣組)。

1.3.1 MTT 檢測細胞生長曲線變化 待NK 細胞長滿后調整細胞濃度為5×104cells/ml,接種于96孔培養板,每孔100μl,37 ℃,5% CO2培養箱內培養24 h。按實驗分組處理細胞,細胞放入不同濃度的氫氣中培養2 h 后,放入37 ℃,5%CO2培養箱中培養12、24、36、48、72 h后進行MTT 檢測。在每孔加入10μl的MTT,37 ℃,5%CO2培養箱內培養避光孵育4 h。在每孔加入100μl的Formazan溶解液,37 ℃,5%CO2培養箱內培養孵育4 h。酶標儀570 nm 波長測出同一時間點OD 值,用測得的OD 值進行細胞生長曲線的分析。

1.3.2 流式分析細胞周期 待細胞長滿后調整細胞濃度為1×105cells/ml,接種于6孔培養板,每孔3 ml培養液,37 ℃,5% CO2培養箱內培養24 h。按實驗分組處理細胞,細胞放入不同濃度的氫氣中培養2 h后,放入37 ℃,5% CO2培養箱培養24、48 h后,進行周期檢測。將孔板中的細胞收集至離心管中,1 000 r/min 離心3 min (離心半徑15 cm),棄去培養液。將細胞沉淀用2 ml PBS洗滌1 次。離心去PBS,加入冰預冷的70%乙醇,4 ℃固定過夜。1 000 r/min離心3 min (離心半徑15 cm),棄去固定液,用PBS 洗細胞,1 000 r/min離心3 min (離心半徑15 cm)。加入500μl的PBS含100 mg/L RNase A,37 ℃孵育30 min。30 min后加入PI使其濃度為50 mg/L。避光37 ℃孵育30 min。冷PBS 溶液洗滌細胞,1 000 r/min 離心3 min (離心半徑15 cm)。取200μl的單細胞懸液,流式上機檢測,CELL Quest軟件分析。

1.3.3 酶聯免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析細胞分泌炎癥因子的變化 按實驗分組處理細胞,細胞放入不同濃度的氫氣中培養2 h后,放入37℃,5%CO2培養箱中培養24 h后進行ELISA 檢測。實驗操作參考試劑盒說明書。

1.4 氫氣對NK 細胞殺瘤能力的作用 實驗分組為對照組：NK 細胞+A549細胞 (共培養比例為1∶1);實驗組：NK 細胞+A549細胞 (共培養比例為1∶1)+20%氫氣組、NK 細胞+A549細胞(共培養比例為1∶1)+40%氫氣組、NK 細胞+A549細胞(共培養比例為1∶1)+60%氫氣組。

1.4.1 單克隆形成能力變化 取處于對數生長期的細胞,將細胞懸浮于培養基中,計數3次,取平均值,調整細胞懸液濃度 (500 cell/個),接種時十字方向搖晃培養板,振動培養板邊,使細胞盡量均勻分布。細胞按實驗分組,處理方式按下述：NK 細胞+A549細胞 (共培養比例為1∶1)對照組為正常培養,20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組為實驗組,對實驗組每天不同濃度通氫氣2 h后,放入37 ℃,5% CO2培養箱中培養。細胞培養1周,每3天更換培養液,觀察克隆形成情況。

1.4.2 劃痕分析細胞遷移能力 先用marker筆在3.5 cm 皿背后,用直尺比著,均勻地劃橫線,大約每隔0.5～1 cm 一道,橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在3.5 cm 皿加入約含3×105個細胞懸液,保證過夜細胞密度為90%。第2 天用200μl槍頭比著直尺,盡量垂直于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不要傾斜。用PBS 洗細胞3 次,去除劃下的細胞。細胞按實驗分組,處理方式按下述：NK 細胞+A549細胞 (共培養比例為1∶1)對照組為正常培養,20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組為實驗組,對實驗組每天不同濃度通氫氣2 h后,放入37 ℃,5%CO2培養箱中培養。24 h后于倒置顯微鏡下觀察劃痕中細胞遷移情況。

1.4.3 Transwell分析細胞侵襲能力 人工基底膜制備：取出-20 ℃保存的Matrigel,將其在4 ℃下過夜解凍,在4 ℃進行操作;將無聚碳酸脂聚乙烯吡咯烷酮微孔濾膜 (微孔直徑3μm)的Boyden小室放置到24孔培養板,形成上下兩室。將制備的人工基底膜30μl加入每個Boyden小室的上室,37 ℃孵育2 h使其呈凝膠狀。取處于對數生長期的細胞,調整細胞濃度為5×105cells/ml,接種于上室每孔200μl,下室加入1 ml的完全培養基,細胞按實驗分組設計,于37 ℃,5% CO2培養箱內培養24 h。將細胞按以下處理方式：NK細胞+A549細胞(共培養比例為1∶1)對照組為正常培養,20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組為實驗組,對實驗組每天不同濃度通氫氣2 h后,放入37 ℃,5%CO2培養箱中培養。24 h后取出小室,吸棄上室液體,用棉簽仔細擦凈膜上未侵襲的細胞以及人工基底膜膠,37 ℃預溫的PBS液漂洗2次,用冰預冷的4%多聚甲醛固定30 min,蘇木素染色5 min。蒸餾水清洗后,于顯微鏡下觀察拍照。

1.5 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗,多組間比較采用F檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NK 細胞的流式細胞儀檢測結果 由圖1可知,CD3-/CD16+CD56+NK 細胞的表達水平為37.6%。

圖1 自然殺傷細胞的流式細胞儀檢測結果

2.2 氫氣對NK 細胞增殖能力的作用

2.2.1 MTT 檢測細胞生長曲線變化 通過MTT法檢測NK 細胞生長曲線發現：12 h 時對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組OD 值均為0.46±0.01;24 h 時對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組OD 值均為0.54±0.01;36 h時對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組OD 值均為0.63±0.01;48 h時對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組OD 值均為0.85±0.01;72 h時對照組、20%氫氣組、40%氫氣組OD 值均為0.90±0.01,而60%氫氣組OD 值為0.82±0.01,差異無統計學意義。見圖2。

圖2 四甲基偶氮唑藍檢測自然殺傷細胞生長曲線

與正常NK 細胞相比,60%的氫氣處理NK 細胞后,從48 h后對NK 細胞增殖生長略顯些抑制作用。40%及20%的氫氣對NK 細胞增殖幾乎沒影響。

2.2.2 流式分析細胞周期 24 h后通過流式細胞儀檢測NK 細胞周期發現,對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組G0/G1期周期率分別為62.97%、63.28%、63.91%、61.93%;對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組G2/M 期周期率分別為15.02%、13.97%、15.07%、14.50%;對照組、20% 氫氣組、40% 氫氣 組、60%氫氣組S期周期率分別為22.01%、22.75%、21.03%、23.56% (圖3)。48 h 后通過流式細胞儀檢測NK 細胞周期發現,對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組G0/G1期周期率分別為66.48%、67.99%、65.00%、67.71%;對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組G2/M 期周期率分別為6.88%、6.57%、6.52%、8.88%;對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組S期周期率分別為26.62%、25.43%、28.47%、23.41% (圖4)。

由此可見,與正常NK 細胞相比,不同濃度的氫氣處理NK 細胞后,對NK 細胞周期影響不大。

2.2.3 ELISA 分析細胞分泌炎癥因子的變化 結果顯示,對照組、20%氫氣組、40%氫氣組、60%氫氣組IL-4濃度分別為 (8.07±0.38)、 (7.56±0.22)、(7.82±0.79)、 (7.31±0.38)ng/L;對照組、20% 氫氣組、40% 氫氣組、60% 氫氣組IFN-γ濃度分別為 (20.90±1.28)、 (21.46±0.97)、 (21.09±0.37)、 (22.36±2.05)ng/L,差異均無統計學意義。見圖5、6。

圖3 24 h后流式細胞儀檢測自然殺傷細胞周期結果

圖4 48 h后流式細胞儀檢測自然殺傷細胞周期結果

圖5 酶聯免疫吸附試驗分析自然殺傷細胞分泌IL-4變化

圖6 酶聯免疫吸附試驗分析自然殺傷細胞分泌干擾素-γ變化

與對照組相比,20%、40%、60%不同濃度的氫氣處理NK 細胞后,對炎癥因子IL-4、IFN-γ的釋放影響不大。

2.3 氫氣對NK 細胞殺瘤能力的作用

2.3.1 A549細胞單克隆形成能力變化 與對照組相比,60%的氫氣處理共培養體系后,對A549細胞單克隆生長有輕度抑制作用,40%及20%的氫氣對A549細胞單克隆生長能力沒差別(圖7)。

圖7 A549細胞單克隆形成能力變化

2.3.2 劃痕分析細胞遷移能力 與對照組相比,60%的氫氣處理共培養體系后,對A549細胞遷移有輕度抑制作用,40%及20%的氫氣對A549細胞遷移能力沒差別(圖8)。

2.3.3 Transwell分析細胞侵襲能力 與對照組相比,60%、40%及20%不同濃度的氫氣處理對A549細胞侵襲能力沒差別(圖9)。

3 討論

早在20世紀70年代,《科學》雜志首次發表了氫氣作為自由基催化劑治療應用的這一里程碑式的文章。在沒有爆炸風險的情況下,連續吸入高壓氫氣(97.5%)2周使得動物皮膚腫瘤或白血病顯著消退,并認為是通過氫氣的抗氧化作用實現的[3]。2001年Gharib等[4]首次證明氫氣具有抗炎作用,并不斷表明了保護機制至少部分存在于氫分子與羥自由基的反應。2007 年Ohsawa等[5]深入闡明了常壓下動物吸入2%的氫氣具有選擇性抗氧化特性,可有效地清除氧自由基,顯著改善腦缺血再灌注損傷。近幾年,對氫氣的研究更是呈現井噴式發展,涉及多個領域和疾病,如缺血再灌注損傷、神經系統損傷、電離輻射損傷、動脈粥樣硬化、炎癥反應、消化系統、膿毒血癥、失血性休克等[1,6-7]。氫氣抗氧化的優點包括：(1)其生物膜高滲透能力和細胞內迅速擴散能力,使其能夠達到亞細胞區如線粒體;(2)可以選擇性地清除有害的羥自由基和過氧亞硝基陰離子,同時保留其他重要活性氧和氮物種的正常信號調節[5,8]。氫氣現在被認為是一種信號氣體分子,生理功能類似于一氧化氮、一氧化碳和硫化氫[9]。實際上,即使在高濃度下,氫氣也沒有細胞毒性,與其他氣體相比,確保了安全特性[10]。

圖8 劃痕分析A549細胞遷移能力 A：遷移前;B：對照組;C：20%氫氣組;D：40%氫氣組;E：60%氫氣組

圖9 Transwell分析A549細胞侵襲能力 A：對照組;B：20%氫氣組;C：40%氫氣組;D：60%氫氣組

NK 細胞作為天然免疫應答中關鍵的效應細胞,是一群不同于T、B淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞,分布于外周各淋巴器官及血液循環系統,無需抗原的預先刺激與活化即可發揮細胞毒效應,并可分泌多種細胞因子及趨化因子。它可以非特異性殺傷腫瘤細胞,是機體免疫監視系統中的一個重要組成部分,同時能夠產生IFN-γ和IL-4等細胞因子,參與機體免疫調節。其細胞表面標志主要是CD16和CD56[11-13]。近年來,關于NK 細胞過繼性免疫治療腫瘤的研究與日俱增,已逐漸開展臨床應用并獲得一定的療效。

本研究選擇了外周血CD16+CD56+為研究對象,觀察20%、40%、60%不同濃度氫氣對NK細胞的功能影響。由MTT 檢測可知,與正常細胞相比,60%的氫氣處理細胞,48 h 后對NK 細胞增殖生長略微有些抑制作用;而從細胞因子的分泌來看,60%氫氣使NK 細胞分泌IFN-γ有些上升,使NK 細胞分泌IL-4有些下降,但均無統計學意義。而20%、40%的氫氣無論對NK 細胞增殖還是細胞因子分泌上來看,均無明顯影響。由流式細胞儀檢測可知：與正常細胞相比,20%、40%、60%不同濃度的氫氣處理NK 細胞后,對細胞周期影響不大。這說明20%、40%、60%不同濃度的氫氣對NK 細胞的增殖無明顯促進和抑制作用,對細胞周期影響不大。在NK 細胞與A549細胞共培養體系中,加入20%、40%、60%不同濃度氫氣觀察NK 細胞殺瘤能力,發現在A549細胞單克隆生長能力和細胞遷移能力方面,60%的氫氣有輕度抑制作用,20%、40%濃度的氫氣與NK 細胞和A549細胞正常培養的作用無差別。Transwell分析細胞侵襲能力方面,與NK 細胞和A549細胞正常培養相比,20%、40%、60%不同濃度的氫氣處理對A549細胞侵襲能力沒差別。最近有學者研究表明,氫氣能抑制癌細胞增殖和轉移,也能促進細胞發生凋亡。更有意思的是,氫氣能誘導肺癌A549和H1975 細胞發生G2/M 阻滯[14]。細胞周期是一個受嚴密調控的有序發生的事件,基因組DNA 完成復制,隨后基因組均等地分裂成2個相似的細胞。細胞周期調控需要大量的胞內外信號的配合,如果缺乏適當的信號,細胞將不能從一個階段進入下一個階段,這種現象稱為細胞周期阻滯。本研究表明,在確保安全前提下,60%濃度的氫氣聯合NK 細胞有助于抑制A549細胞單克隆生長和細胞遷移能力,從而抑制腫瘤生長,它們之間存在的作用是否為協同作用,以及存在的作用機制需要今后科學研究和體內實驗的開展進一步證實。

根據NK 細胞表面CD56密度的不同,可將其分CD56dim和CD56bright2種亞型,人體90%以上的NK 細胞為高表達IgG 低親和力Fc 受體(FcγRⅢ,即CD16)且具有強烈的細胞毒效應的CD56dim細 胞,而可產生大量細胞因子的CD56bright細胞不到10%[15]。研究指出[16-17],CD56bright亞型的NK 細胞本身具有一定的抗氧化能力。本次研究只針對CD56+NK 細胞,未能細分CD56亞型,或許NK 細胞與氫氣的抗氧化效應是否有協同作用尚未可知,但筆者觀察到了60%高濃度氫氣聯合NK細胞有助于抑制A549細胞單克隆生長和細胞遷移能力,從而抑制腫瘤生長,達到治療的目的。這為今后氫氣和NK 細胞免疫治療聯合治療肺癌奠定了實驗基礎。但氫氣的濃度上限和體內試驗療效以及涉及的分子機制和信號通路有待于進一步研究和論證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突