PKIB表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖與侵襲影響的實(shí)驗(yàn)研究*

程卓鑫 劉 淘 王國(guó)才 曲義坤 徐 劍 劉偉新 焦成斌

佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科，黑龍江省佳木斯市 154002

PKIB是一種新的耐熱蛋白,它由78個(gè)氨基酸殘基組成是PKI家族的成員，研究顯示PKIB基因與乳腺癌、前列腺癌及肺癌等眾多腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[1-2]，尤其是PKIB在乳腺癌細(xì)胞增殖中起重要作用[1]。而PKIB表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的相關(guān)研究較少。筆者通過觀察PKIB表達(dá)程度的改變對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲影響，探討其與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑 人胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞株P(guān)ANC-1、正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。β-肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)于美國(guó)加州圣克魯斯生物技術(shù)公司。PKIB 抗體購(gòu)于美國(guó) Abcam (Cambridge, MA, USA)。其余實(shí)驗(yàn)所用材料均來自佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞,人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1培養(yǎng)在37℃、1640培養(yǎng)液加入10%的胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、空氣95%、二氧化碳5%的培養(yǎng)箱中。

1.3 shRNA-PKIB和PKIB過表達(dá)基因的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 shRNA-PKIB和PKIB過表達(dá)基因由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。PANC-1細(xì)胞(4×105)接種于6孔板，無(wú)雙抗RPMI 1640孵育24h，使細(xì)胞鋪板面積至30%～50%，每孔加入LipofectamineTM2000 5μl及shRNA和PKIB過表達(dá)基因100pmol分別充分混勻后，于無(wú)血清及雙抗的培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)染，37℃孵育6h后更換新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液， 恒溫常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h后，并按設(shè)計(jì)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot檢測(cè)PKIB蛋白表達(dá) 將經(jīng)過不同處理的細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)48h后經(jīng)過均勻加工和RIPS緩沖器超聲處理。在4℃12 000g離心10min移除雜質(zhì)。取50μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，然后移至聚偏氟乙烯(PVDF)薄膜。3%牛血清白蛋白(BSA)固定薄膜，加入一抗，接著PBST洗膜后加入二抗。加入硝基藍(lán)四氮唑后顯影。β-actin作為內(nèi)參照。

1.5 RT-PCR檢測(cè)PKIB的mRNA表達(dá)水平 應(yīng)用Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)。引物由Applied Biosystems Primer Express 3.0特定設(shè)計(jì)。特定引物用BLAST 程序固定。每20μl反應(yīng)包含 1x SYBR? Premix Ex Taq TM II,10μM正向和反向引物、0.4μl ROX reference染料、cDNA 2μl。ABI 7300 測(cè)序儀反應(yīng)條件：95℃30s、95℃5s共40個(gè)周期、60℃30s。靶基因表達(dá)的相關(guān)定量(RQ)由2-ΔΔCT方法計(jì)算。RQ分析的第一步是檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)β-肌動(dòng)蛋白(ΔCt)靶基因表達(dá)水平。第二步是比較不同樣本中標(biāo)準(zhǔn)靶基因表達(dá)的不同。每個(gè)樣品的PCR反應(yīng)重復(fù)3次。

1.6 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC-1細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板。該細(xì)胞培養(yǎng)24h后分別做不同處理后標(biāo)記為shRNA-PKIB細(xì)胞組、PKIB過表達(dá)細(xì)胞組和空轉(zhuǎn)載體對(duì)照組，繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)72h后各孔加入5g/L MTT 20μl,繼續(xù)置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，后各孔加入標(biāo)準(zhǔn)濃度二甲基亞砜(DMSO)200μl，震蕩混勻15min，用酶標(biāo)儀于540nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 不同的細(xì)胞分組以5×103個(gè)/孔被種植在6孔板，放置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7d，2～3d換1次培養(yǎng)基。然后用預(yù)先保溫磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，之后保留的細(xì)胞用結(jié)晶紫溶液染色2h(0.5%結(jié)晶紫，20%甲醇)。將培養(yǎng)皿反復(fù)洗滌3次，除去結(jié)晶紫溶液。待培養(yǎng)皿在37℃下干燥后用照相機(jī)采取樣本圖片。

1.8 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn) 于Transwell小室中加入60μg Matrigel膠(用2倍體積的無(wú)血清RPMI 1640稀釋)，37℃、30min待膠凝固，在小室下部分為含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(5×104個(gè))常規(guī)培養(yǎng)24h，取出小室，PBS洗滌，用棉簽小心擦去微孔膜內(nèi)層的細(xì)胞，95%酒精固定，結(jié)晶紫染色。每張膜計(jì)數(shù)5個(gè)100倍顯微鏡視野下的穿膜細(xì)胞數(shù)，照相并計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 定性數(shù)據(jù),包括蛋白免疫印跡和細(xì)胞圖像等，每組至少重復(fù)3次。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±SD表示，統(tǒng)計(jì)兩組之間的差異以雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在胰腺癌細(xì)胞中PKIB的表達(dá)上調(diào) 為確定PKIB表達(dá)與胰腺癌的相關(guān)性，首先應(yīng)用Western blot檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中PKIB的表達(dá)。結(jié)果胰腺癌細(xì)胞與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比較PKIB的表達(dá)明顯上調(diào)(圖1-1和圖1-2)[PKIB：(0.15±0.03)VS(0.30±0.06),t=9.87,P<0.001]。由此說明PKIB可能與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。

圖1-1 Western blot試驗(yàn)檢測(cè)正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞與PANC-1細(xì)胞PKIB蛋白的表達(dá)情況

圖1-2 正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞與PANC-1細(xì)胞PKIB蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.2 PKIB過表達(dá)促進(jìn)PANC-1細(xì)胞增殖 PKIB過表達(dá)基因轉(zhuǎn)染PANC-1后，應(yīng)用RT-PCR與Western blot檢測(cè)PKIB mRNA與蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明PKIB mRNA表達(dá)增多(圖2-1)[mRNA：(1.00±0.30)VS(2.20±0.51),t=9.23,P<0.001]，同時(shí)蛋白表達(dá)增多(圖2-2和圖2-3)[PKIB:(0.30±0.09)VS(0.59±0.11),t=9.73,P<0.001]。然后應(yīng)用MTT檢測(cè)PKIB過表達(dá)對(duì)PANC-1存活能力的影響，結(jié)果表明PKIB過表達(dá)PANC-1的存活能力增強(qiáng)(圖2-4)[存活：(1±0.29)VS(1.7±0.34),t=7.22,P<0.001]。應(yīng)用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PANC-1的增殖能力，結(jié)果表明PKIB過表達(dá)增強(qiáng)胰腺癌的增殖能力(圖 2-5)。以上結(jié)果顯示PKIB的過表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖，并提高其生存能力。

圖2-1 RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組mRNA表達(dá)情況

圖2-2 Western blot試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組蛋白的表達(dá)情況

圖2-3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)駔PKIB蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖2-4 MTT試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間的相對(duì)活力

圖2-5 結(jié)晶紫試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

2.3 沉默PKIB表達(dá)可抑制PANC-1細(xì)胞增殖 shRNA-PKIB轉(zhuǎn)染PANC-1后沉默PKIB的表達(dá)PKIB mRNA(圖3-1)[mRNA：(1.00±0.26)VS(0.30±0.08),t=11.67,P<0.001]與蛋白表達(dá)量明顯減少(圖3-2 和圖3-3)[PKIB：(0.28±0.05)VS(0.06±0.01),t=9.23,P<0.001]。應(yīng)用MTT檢測(cè)PKIB表達(dá)減少對(duì)PANC-1存活能力的影響，結(jié)果表明沉默PKIB表達(dá)降低PANC-1的存活能力(圖3-4)[存活：(1.00±0.39)VS(0.53±0.20),t=4.85,P<0.001]。應(yīng)用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PANC-1的增殖能力，結(jié)果表明沉默PKIB表達(dá)抑制PANC-1的增殖(圖3-5)。由此說明沉默PKIB表達(dá)可抑制PANC-1細(xì)胞增殖，降低其存活能力。

圖3-1 RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組mRNA表達(dá)情況

圖3-2 Western blot試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組蛋白的表達(dá)情況

圖3-3對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組PKIB蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖3-4 MTT試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間的相對(duì)活力

圖3-5 結(jié)晶紫試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

2.4 PKIB表達(dá)程度影響PANC-1侵襲能力 胰腺癌細(xì)胞的侵襲是導(dǎo)致胰腺癌患者死亡的主要原因。通過檢測(cè)PKIB的表達(dá)程度來說明其對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明PKIB過表達(dá)增強(qiáng)PANC-1侵襲能力(圖4-1和圖4-2)[侵襲：(1.00±0.32)VS(2.70±0.39),t=15.64,P<0.001]，沉默PKIB表達(dá)后PANC-1的侵襲數(shù)明顯減少(圖4-3和圖4-4)[侵襲：(1.00±0.26)VS(0.40±0.14),t=9.23,P<0.001]。由此可說明PKIB在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。

圖4-1 Transwell侵襲試驗(yàn)

圖4-2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞相對(duì)數(shù)

圖4-3 Transwell侵襲試驗(yàn)

圖4-4 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞相對(duì)數(shù)

3 討論

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前5年生存率不足5%[3]。胰腺癌臨床發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，臨床上的確定診斷病例大多為晚期，大部分患者就診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而進(jìn)展期胰腺癌的治療由于其惡性度高，對(duì)化療藥物有耐藥性，當(dāng)前尚缺乏理想的化療藥物。胰腺癌患者的低生存率和對(duì)化療藥物的敏感性差是目前胰腺癌治療中面臨的最大困難，然而靶向分子治療已成為胰腺癌治療的新熱點(diǎn)。PKIB是一種新的耐熱蛋白,它由78個(gè)氨基酸殘基組成是PKI家族的成員，PKI包括3個(gè)不同的亞型:PKIα、PKIβ、PKIγ,每個(gè)亞型在腦中均有表達(dá)。PKIβ最初是從兔睪丸分離得到,在人和大鼠組織中也被證實(shí)[5]。已有研究表明PKIB基因與眾多腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。PKIB的表達(dá)對(duì)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，并且與Akt存在密切的關(guān)聯(lián)[1]。PKIB過表達(dá)可增強(qiáng)前列腺癌的侵襲能力，同樣與Akt關(guān)系密切[2]。而先前大量的實(shí)驗(yàn)研究表明Akt的異常表達(dá)與激活可調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，影響胰腺癌細(xì)胞的生存能力，并對(duì)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力起重要作用[6]。PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞增殖、生存、抗凋亡，59%的胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)存在PI3K/Akt信號(hào)通路[7]，本實(shí)驗(yàn)就此探究PKIB表達(dá)對(duì)胰腺癌增殖與侵襲的影響。本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比PKIB的表達(dá)明顯上調(diào)。而且PKIB表達(dá)程度與胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)。由此可說明PKIB極可能作為一種致癌基因調(diào)控胰腺癌的增殖和侵襲。

腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖及轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生并導(dǎo)致患者死亡的重要原因，而腫瘤細(xì)胞增殖能力的提升和其凋亡的抑制直接導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的過度增長(zhǎng)。以此為出發(fā)點(diǎn)可為腫瘤的分子靶向治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示PKIB的表達(dá)程度與胰腺癌的生物學(xué)行為息息相關(guān)。PKIB過表達(dá)促進(jìn)PANC-1細(xì)胞的增殖，而沉默其表達(dá)可抑制PANC-1細(xì)胞增殖。由此可說明PKIB參與胰腺癌細(xì)胞的增殖并且起促進(jìn)作用。導(dǎo)致癌癥患者死亡的另一重要的原因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)證明了PKIB表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的侵襲起重要作用。結(jié)果表明PKIB過表達(dá)增強(qiáng)PANC-1侵襲能力，而沉默PKIB表達(dá)抑制PANC-1侵襲能力。以上結(jié)果雖然可證明PKIB作為原癌基因參與調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的增殖，但其作用機(jī)制和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的確定還需進(jìn)一步的研究。此外，本實(shí)驗(yàn)是在體外細(xì)胞系進(jìn)行，PKIB對(duì)發(fā)病的影響還應(yīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)行更深一步研究。

綜上所述，PKIB的表達(dá)是胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，影響了胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。調(diào)節(jié)PKIB的表達(dá)或許是胰腺癌治療的一種新策略，為胰腺癌的治療提供了新的、潛在的治療靶點(diǎn)。