子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-205檢測(cè)方法的建立*

李 軍，蔡 虎

（1.陜西省藥品技術(shù)審核查驗(yàn)中心，陜西 西安 710065； 2.陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，陜西 西安 712046）

MicroRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，其5′端為磷酸基團(tuán)、3′端為羥基基團(tuán)，長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸。miRNA主要通過(guò)結(jié)合mRNA來(lái)抑制蛋白翻譯過(guò)程或酶解切割mRNAs來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)［1］。最新研究表明，miR-205在許多類型的癌癥中均異常表達(dá)，如頭頸部腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、膀胱腫瘤和子宮內(nèi)膜癌等［2-4］。子宮內(nèi)膜癌為最常見(jiàn)的婦科腫瘤，占婦科惡性腫瘤的20%～30%，嚴(yán)重威脅女性健康。子宮內(nèi)膜癌好發(fā)于絕經(jīng)后婦女，但近年來(lái)發(fā)病人群有年輕化趨勢(shì)，且其發(fā)病率不斷上升。本研究中建立了熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法，檢測(cè)miR-205在子宮內(nèi)膜癌患者血清中的表達(dá)，探討能否將miR-205作為新的腫瘤標(biāo)志物，用于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本血清、儀器與試劑

樣本血清：以擇期行婦科手術(shù)的8例子宮內(nèi)膜癌患者為試驗(yàn)組，年齡36～65歲，平均44歲；以10例健康者為健康對(duì)照組，年齡38～52歲，平均45歲。上述研究對(duì)象均取外周靜脈血3mL，常規(guī)分離血清，于-80℃貯存。

儀器：CFX384型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）儀（美國(guó)BioRad公司）；DU 700型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；CT15RE型高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）；MDF-U5412型-80℃低溫冰箱（日本 Sanyo公司）；MX-S型渦旋振蕩器（美國(guó)Sciloge公司）；EPOCH型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

試劑：Trizol（日本 Takara 公司，批號(hào)為 9108）；miR-205，U6 Primer（廣州銳博生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑和 SYBR Green PCR reagents（日本Toyobo公司）；C反應(yīng)蛋白酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào)為XS01804）；基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）ELISA試劑盒（上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為HS3345）；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）、水（華美生物工程有限公司）。

1.2 方法

總RNA的提取：取樣本血清300 μL，加入Trizol試劑1 mL，振蕩裂解細(xì)胞，室溫靜置30 min；加入氯仿200 μL 混勻，冰置 10 min。4 ℃下，12 000 r/min離心10 min；取上清液 200 μL，加異丙醇 200 μL，上下顛倒混勻，冰置 15 min；4 ℃下，12 000 r/min 離心 10 min；棄上清液，加DEPC水1 mL配制的75%乙醇混勻，4℃下，12 000 r/min離心10 min；棄上清液，冰上晾干5～10 min，加入 DEPC 水 20～30 μL 溶解 RNA。在 260 nm和280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD）值，確定RNA的純度和濃度。

cDNA的合成：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 μL，dNTP 0.75 μL，miR-205 逆轉(zhuǎn)錄引物1.2 μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0.2 μL，總 RNA 樣本 5 μL，DEPC 水 8.85 μL。反應(yīng)條件為 16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。

血清中miR-205含量的檢測(cè)：PCR反應(yīng)體系（10 μL）為 SYBR 5 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA 模版 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL，DEPC 水 3.1 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性12 s，62℃退火50 s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴(kuò)增曲線的可靠性，并設(shè)定循環(huán)閾值（Ct），以miR-205/Ub比值代表其相對(duì)表達(dá)水平，2-△△Ct法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

血清中CRP和MMP-2含量的檢測(cè)：取樣本血清適量，各孔加入相應(yīng)待測(cè)樣本血清40 μL及抗CRP和MMP抗體10 μL，每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體50 μL，以封板膜封住反應(yīng)孔，37℃孵育1 h；棄上清液，重復(fù)洗5次；每孔加入底物 A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的OD值。以O(shè)D值代表其相對(duì)含量。設(shè)立對(duì)照孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品純度

樣品總 RNAOD260/OD280在 1.8～2.0之間（見(jiàn)表1），表明提取純度較好，RNA幾乎無(wú)降解，可進(jìn)行下一步的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

表1 樣品總RNA質(zhì)量濃度（ng/μL）

2.2 引物特異性

miR-205和U6的熔解曲線峰值單一，未見(jiàn)其他雜峰信號(hào)；miR-205熔解溫度為75.4℃，U6熔解溫度為80.3℃（見(jiàn)圖1）。說(shuō)明本試驗(yàn)中設(shè)置的RT-PCR參數(shù)合理，miR-205、U6逆轉(zhuǎn)錄引物和擴(kuò)增引物能成功擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的片段，產(chǎn)物特異性較好，試驗(yàn)結(jié)果較可靠。

2.3 miR-25表達(dá)水平

健康對(duì)照組產(chǎn)生微弱的非特異性信號(hào)，且明顯滯后于試驗(yàn)組。試驗(yàn)組患者血清中miR-205的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2。

2.4 CRP和MMP-2含量

試驗(yàn)組患者血清CRP的含量為5.367 mg/L，顯著高于健康對(duì)照組的 2.432 mg/L（P＜0.05），兩組的MMP-2含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖3。

圖1 熔解曲線

圖2 miR-205表達(dá)水平

圖3 CRP和MMP-2含量

3 討論

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前尚無(wú)有效的預(yù)防機(jī)制。miRNA是一類非編碼小分子RNA，其通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合特異的靶向mRNA，從而抑制靶向mRNA的翻譯或降解靶向mRNA，從而發(fā)揮其癌基因或抑癌基因的功能。

有研究利用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者的血清中有多個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，其中miR-205的上調(diào)最顯著［5］。也有報(bào)道 miR-205和 miR-342可作為診斷三陰性乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物［6］，miR-205通過(guò)靶向ZEB1和Ubc13作為腫瘤的放射致敏劑［7-8］。miR-205下調(diào)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移，且能促進(jìn)抑癌基因JPH4的表達(dá)，從而抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展［3-4］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞抑制靶向Akt-mTOR通路的miR-205，為孕激素受體型子宮內(nèi)膜癌提供了一種潛在的、新的治療方法［9］，miR-205通過(guò)靶向 PTEN 調(diào)控人子宮內(nèi)膜癌［10］。SU 等［11］發(fā)現(xiàn)，miR-205通過(guò)靶向子宮內(nèi)膜癌中的抑癌基因ESRRG促進(jìn)了腫瘤的增殖和侵襲。

本研究中建立了RT-PCR法檢測(cè)血清中的miR-205，該方法快速便捷、靈敏度高、特異性好。但由于樣本量較少，今后還需增加樣本量進(jìn)一步證明該方法的穩(wěn)定性。同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)CRP在子宮內(nèi)膜癌患者的血清中異常高表達(dá)。由于miR-205與腫瘤浸潤(rùn)相關(guān)，而CRP也與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此推測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者miR-205的異常表達(dá)可能是由于CRP的高表達(dá)引起。由于miR-205在多種腫瘤中存在表達(dá)異常，能否通過(guò)兩種或多種miRNA聯(lián)合診斷子宮內(nèi)膜癌的設(shè)想，也為今后的臨床研究提供了新的思路。