紅酵母固態發酵農林廢棄物接種量對菌體生長及營養成分的影響

苗欣宇，牛紅紅，李 達，鄭 麗，遲燕平，蘇 穎，劉佳彤，王景會

（吉林省農業科學院農產品加工研究所，吉林長春 130033）

0 引言

紅酵母，屬于隱球酵母科[1]。其發酵產物中含有β-胡蘿卜素[2]、紅酵母紅素[3]和γ-胡蘿卜素[4]等多種類胡蘿卜素成分，在發酵過程中分解大分子蛋白質和糖類化合物。類胡蘿卜素是一類黃色或紅色的多烯類化合物，均有抗氧化性[5]，能有效抑制細胞中生物大分子被自由基損害，起到抗衰老、提高免疫能力的作用。有研究證明，類胡蘿卜素可以保護細胞、抑制慢性退行性疾病的發生，以及抑制正常體細胞的變異、腫瘤細胞的生長，并且在促進兒童身體發育方面有重要作用[6]。然而，人體和動物體內不能自主合成類胡蘿卜素，只能從食物中攝取，已經有很多國家允許類胡蘿卜素添加劑用作食品營養強化劑、飼料增色劑[7]等。

近年來，國內對紅酵母屬的研究越來越豐富，尤其是紅酵母的發酵工藝和發酵產物的活性成分研究頗多。趙笛[8]通過優化酸熱破壁條件對紅酵母細胞進行破壁，最終使蝦青素的提取率達到911.6 μg/g，并研究向培養基投放前體物質對菌體生長及色素積累的影響。Tapingkae W等人[9]在雞飼料中添加紅酵母，酵母補充組的蛋黃顏色變深，HMG-CoA還原酶活性顯著降低，降低了血清和蛋黃中的膽固醇含量。紅酵母發酵可以增加飼料中的類胡蘿卜素，增強抗氧化能力，可增強機體的免疫能力，提高禽蛋的品質和風味[10]，并可以改善肉雞的腸道形態結構及提高肉雞生產性能和屠體性能[11]。此外，新疆的哈薩克族牧民在用駱駝乳生產酸駱駝乳中可以分離出一株紅酵母，其可以增加駱駝乳中的營養價值，并起到抗菌、抑霉的作用[12]。

試驗以農林廢棄物，豆粕、麩皮和酒糟混合制成固體培養基，利用從土壤中篩選出的一株紅酵母CCYZ116進行固態發酵。經過紅酵母的發酵，研究固體培養基中的類胡蘿卜素含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量的變化，進一步為農林廢棄物回收再利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酵母，吉林省農業科學院食品微生物實驗室在吉林省長春市凈月區的土壤中分離鑒定提供，并保藏命名為CCYZ116。

斜面培養基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂。

液態發酵培養基：10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，40 g/L葡萄糖。裝液量為50 mL于250 mL三角瓶中。

固態培養基：將酒糟、豆粕和麩皮研磨至40目，酒糟∶豆粕∶麩皮配比為1∶3∶2，按比例稱好培養基，均勻攪拌，分別取50 g置于500 mL燒杯中，封口包扎，于121℃下滅菌40 min[13]。

1.2 儀器與設備

MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司產品；HZQ-X100型全溫振蕩培養箱、DHP-9272型電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司產品；Cary 300型紫外可見光分光光度計，美國Varian公司產品；Evolution RC型高速冷凍離心機，美國Thermo Stovall公司產品；DL-CJ-2ND型超級潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 種子培養

CCYZ116種子培養：在CCYZ116斜面上挑取菌落，接種于液體培養基中。溫度為30℃，以轉速230 r/min振蕩培養48 h。

接種量不同處理：

（1） 空白組。接入15 mL滅菌蒸餾水為空白對照，于30℃下培養72 h。

（2） 原液培養組。將15 mL CCYZ116液體發酵液離心，棄上清，用15 mL滅菌蒸餾水水重懸接入固體培養基中，于30℃下培養72 h。

（3） 2.5倍濃縮培養組。將37.5 mL CCYZ116液體發酵液離心，棄上清，用15 mL的滅菌蒸餾水水重懸接入固態培養基，于30℃下培養72 h。

（4） 5倍濃縮培養組。將75 mL CCYZ116液體發酵液離心，棄上清，用15 mL的滅菌蒸餾水水重懸接入固態培養基，于30℃下培養72 h。

1.3.2 有效活菌數的測定

采用平板計數法測定有效菌數，每個發酵燒杯攪拌均勻，取5 g加入50 mL無菌水，于搖床中以轉速230 r/min振蕩搖勻30 min，制成CCYZ116懸液。取稀釋至10-4，10-5，10-6倍的菌懸液100 μL于斜面培養基中，30℃培養48 h，對長有30～300個菌落的平板計數。單位：CFU/g。

1.3.3 生物量檢測方法

將5倍于培養物質量的無菌蒸餾水加入到發酵杯中，分次洗滌。用4層紗布依次濾掉雜質，得到菌液。將菌液以轉速3 500 r/min離心15 min，得到濕菌體。將CCYZ116菌體移至預先干燥至恒質量的稱量杯中，于50℃下烘干至恒質量，用分析天平稱量CCYZ116菌體總質量[14]。

CCYZ116菌體生物量計算公式：

式中：W——CCYZ116菌體生物量，g/L；

M——稱量瓶與菌體的總質量，g；

M0——稱量瓶的質量，g；

V——所取濾液量，mL，一般取10 mL。

1.3.4 類胡蘿卜素的測定方法

采用酸熱破壁法[15]。在上述1.3.3方法獲得的濕菌體10 mL中加入10 mL的3 mol/L HCl溶液。將酸溶液在室溫下振蕩浸泡45 min，沸水浴煮沸4～5 min后迅速冷卻。

酸熱破壁后的CCYZ116酸溶液，以轉速4 000 r/min離心15 min，沉淀用無菌蒸餾水反復洗滌2次，加入10 mL丙酮。丙酮溶液于室溫下振蕩1 h提取類胡蘿卜素后，以轉速4 000 r/min離心15 min，得到上清液即為類胡羅卜素提取液。如若離心的沉淀還有顏色殘留，則說明細胞碎片中仍有色素未提取出，可再加丙酮再提取。用分光光度計測定適當稀釋后的浸提液于波長450 nm下的吸光度[16]。類胡蘿卜素含量計算公式為：

式中：Wc——發酵液類胡蘿卜素含量，μg/g；

Amax——最大吸收波長450 nm下的吸光度；

D——測定試樣的稀釋倍數；

V——提取色素用有機溶劑體積，mL；

m——干酵母菌體質量，g；

0.16——類胡蘿卜素的摩爾消光系數。

類胡蘿卜素產量計算公式：

類胡蘿卜素產量（μg/L） =Wc×W.

式中：Wc——發酵液類胡蘿卜素含量，μg/g；

W——CCYZ116菌體生物量，g/L。

1.3.5 可溶性蛋白含量檢測方法

采用凱氏定氮法測定[17]。

1.3.6 可溶性糖含量檢測方法

采用苯酚濃硫酸法測定[18]。

2 結果與分析

2.1 不同接種量對活菌數和菌體生物量的影響

不同接種量對活菌數和菌體生物量的影響見表1。

表1 不同接種量對活菌數和菌體生物量的影響

由表1可知，5倍濃縮組的培養基中的活菌數最高達到了3.64×108CFU/g，菌體生物量最高達到2.644 g/L；2.5倍濃縮組的活菌數為3.60×108CFU/g，菌體生物量最高達到了2.699 g/L，兩組之間沒有顯著差異。但與原液培養組和空白組比較差異顯著（p＜0.05）。結果表明，接種量的增加，顯著提高了培養基的活菌數量和菌體生物量，但濃縮倍數達到2.5倍時對活菌數量和菌體生物量的影響已飽和，不是接菌量越大活菌數量就越高。在實際發酵應用中可適當加大接菌量，達到飽和點后無需再繼續加大接菌量，既可提高發酵效率，又能降低成本。

2.2 不同接種量對類胡蘿卜素含量的影響

不同接種量的CCYZ116固態發酵飼料，對發酵產物中類胡蘿卜素含量的影響。

不同接種量對類胡蘿卜素含量的影響見圖1，不同接種量對類胡蘿卜素產量的影響見圖2。

由圖1可知，5倍濃縮組的類胡蘿卜素含量最高達到了713.22 μg/g，類胡蘿卜素產量最高，達到了1 312.3 μg/L。與2.5倍濃縮組、原液培養組和空白組相比，均顯著提高了發酵產物中的類胡蘿卜素含量和產量 （p＜0.05）。

接種量的不同影響著酵母的生長和發酵產物組分，適宜的接種量可以促進CCYZ116菌體生長，增加菌體生物量。但是，菌體生長的最適接種量與類胡蘿卜素產量的最適接種量不同。王蓉等人[19]研究表明，紅酵母WP3生長和類胡蘿卜素產量最高的發酵條件是不同的。發酵過程中，影響CCYZ116菌體生長和類胡蘿卜素產量的因素還不明確，需要進一步研究探討。

類胡蘿卜素可在植物、動物和微生物的生長繁殖過程中起到關鍵的作用。目前，生產應用中80%～90%的類胡蘿卜素是通過化學合成的，市場上對于天然的類胡蘿卜素的需求量與日俱增。農林廢棄物經過紅酵母CCYZ116的發酵產生了大量的天然類胡蘿卜素，豐富了其營養成分。經過發酵的農林廢棄物，可制作增色飼料，用于水產養殖和家禽養殖等[20-21]。

圖1 不同接種量對類胡蘿卜素含量的影響

圖2 不同接種量對類胡蘿卜素產量的影響

2.3 不同接種量對可溶性蛋白和可溶性總糖含量的影響

不同接種量對可溶性總糖含量的影響見圖3。

圖3 不同接種量對可溶性總糖含量的影響

由圖3可知，2.5倍與5倍濃縮組的可溶性總糖含量分別達到了5.433，5.309 g/100 g，與原液培養和空白組相比顯著提高了飼料中的可溶性總糖含量（p＜0.05）。然而2.5倍濃縮組與5倍濃縮組之間沒有顯著性差異。說明2.5倍的接種量使培養基中可溶性蛋白達到了閾值，在實際應用中無需5倍接種量，以節省成本。

經韓梅等人[22]對紅酵母發酵產物中類胡蘿卜素、蛋白質和脂肪酸的成分進行分析，表明經過紅酵母的發酵后，培養基產生更豐富的氨基酸和脂肪酸，提高培養基的營養價值。

不同接種量對可溶性蛋白含量的影響見圖4。

圖4 不同接種量對可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，2.5倍濃縮、5倍濃縮組和原液培養組，與空白組相比，均顯著提高了可溶性蛋白含量（p＜0.05）。原液組的可溶性蛋白含量最高達到了10.392 g/100 g，顯著地提高了可溶性蛋白含量（p＜0.05）。說明原液組的接種量在發酵過程中培養基中可溶性蛋白含量最高，接種量的增加反而會降低可溶性蛋白含量，這種結果產生的原因和機制需進一步研究。

3 結論

利用從土壤中分離出一株紅酵母的發酵作用來增加農林廢棄物的營養成分。研究不同接種量的CCYZ116固態發酵后農林廢棄物培養基中菌體生長和營養成分的變化。2.5倍濃縮組與空白組、原液組相比顯著地提高了培養基中活菌數（3.64×108CFU/g）和生物量（2.699 g/L，p＜0.05）。5倍濃縮組的類胡蘿卜素含量 （713.22 μg/g） 和產量 （1 312.3 μg/L） 最高，2.5倍濃縮組的可溶性總糖最高達5.433 g/100 g，原液組的可溶性蛋白含量最高為10.392 g/100 g（p＜0.05）。

由此可見，提高紅酵母的接種量，有助于提高紅酵母發酵產物的營養價值、提高發酵效率、降低成本，為農林廢棄物回收利用和紅酵母實際應用的進一步研究和開發提供了理論依據。