MicroRNA-21在胰腺癌細胞增殖和遷移中作用的研究*

趙秋艷 余蘭婷 謝浩然 任迎春 陳素敏 李百文

上海交通大學附屬第一人民醫院(201620)

背景：大量研究表明microRNAs與腫瘤的發生、發展密切相關。MiR-21為最為常見的致癌性microRNAs分子之一，其對胰腺癌細胞增殖、遷移的具體作用及其機制尚未完全闡明。目的：探討miR-21對胰腺癌細胞增殖、遷移的影響及其具體分子機制。方法：以PANC-1和MIA PaCa-2細胞為研究對象，通過轉染慢病毒表達載體分別構建miR-21過表達和敲低的穩轉株，以qRT-PCR法驗證轉染效率。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，qRT-PCR和蛋白質印跡法分別檢測Spry2 mRNA和蛋白表達，螢光素酶報告實驗檢測miR-21對Spry2的調控作用。結果：MiR-21過表達可明顯促進PANC-1細胞增殖和遷移(P<0.05)，miR-21表達下調可明顯降低MIA PaCa-2細胞增殖和遷移(P<0.05)。與對照組相比，miR-21表達上調可明顯降低Spry2 mRNA和蛋白表達(P<0.05)，而敲低miR-21表達可明顯升高Spry2 mRNA和蛋白表達(P<0.05)。上調miR-21表達可抑制含野生型Spry2 3’-UTR序列質粒的螢光素酶活性(P<0.05)，下調miR-21表達則增強螢光素酶活性(P<0.05)。Spry2可逆轉miR-21介導的細胞增殖和遷移(P<0.05)。結論：MiR-21能通過靶向調節Spry2的表達而影響胰腺癌細胞的生物學功能。

胰腺癌是嚴重危害人類健康的常見消化系統腫瘤，亦是預后最差的惡性腫瘤之一[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法，大多數胰腺癌患者確診時即處于疾病晚期，失去了手術治療的機會。因此探討胰腺癌發生、發展的分子機制，并尋找早期診斷和預后判斷指標是胰腺癌研究中亟待解決的重大問題。微RNAs(microRNAs, miRNAs)是一類小分子非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3’端非編碼區(3’-UTR)的堿基互補配對，促進mRNA降解或抑制其翻譯，在轉錄后水平負性調控相關基因的表達[2-4]。大量研究表明，miRNAs失調與腫瘤發生、細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移等密切相關[5-6]。MiR-21作為最為常見的致癌性miRNAs分子之一，在胰腺癌中高表達，然而其對胰腺癌細胞增殖、遷移的具體機制尚不清楚。本研究通過轉染慢病毒表達載體構建miR-21過表達和敲低的穩轉株，旨在探討miR-21對胰腺癌細胞增殖和遷移的影響及其可能的分子機制。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人胰腺癌細胞株PANC-1、MIA PaCa-2購于中國科學院細胞庫；慢病毒的構建由漢恒生物技術(上海)有限公司完成；miR-21 mimics、陰性對照mimics NC、miR-21 inhibitor、陰性對照inhibitor NC、Spry2過表達質粒和空載質粒均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；Spry2敲低寡核苷酸(Si-Spry2)、陰性對照(Si-NC)和EdU試劑盒購于廣州銳博生物技術有限公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；兔抗人Spry2、GAPDH抗體購自美國CST公司；脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；CCK-8細胞增殖試劑盒購自日本同仁化學研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于杭州聯科生物技術股份有限公司；螢光素酶報告質粒由和元生物技術(上海)股份有限公司構建。

二、方法

1. 細胞培養：PANC-1、MIA PaCa-2細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37 ℃、5% CO2條件下培養，每2 d更換一次培養基。當細胞生長至融合度為80%～90%時常規傳代培養。

2. 慢病毒轉染和穩轉株的篩選：取對數生長期細胞接種于6孔板，當細胞匯合率為50%～70%時，加入適量病毒，感染48 h后更換含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮完全培養基，篩選穩定轉染的細胞株。每2～3 d更換一次含嘌呤霉素的完全培養基，直至不感染病毒的篩選對照組細胞被嘌羅霉素殺光，以實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法驗證轉染效率。

3. 細胞轉染：將穩轉株分別接種于6孔板，當細胞匯合率達70%時，應用LipofectamineTM2000對miR-21過表達的PANC-1穩轉株(LV-miR-21)瞬時轉染Spry2過表達質粒(Spry2)和空載質粒(EV)，對miR-21敲低的MIA PaCa-2穩轉株(SP-miR-21)瞬時轉染Si-RNA和Si-NC，6 h后更換培養基，繼續培養24 h，以qRT-PCR法驗證轉染效率。

4. qRT-PCR法：收集各組轉染后的細胞，用預冷的PBS清洗后加入Trizol試劑提取細胞內總RNA，反轉錄為cDNA，行實時熒光定量PCR。miR-21上游引物：5’-CGC GCG TAG CTT ATC AGA CTG A-3’，下游：5’-ATC CAG TGC AGG GTC CGA GG-3’；內參U6上游引物：5’-CAA GGA TGA CAC GCA AA-3’，下游：5’-TCA ACT GGT GTC GTG G-3’；Spry2上游引物：5’-AAG CCA CTG AGC AAG GAA GA-3’，下游：5’-TTG TCG CAG ATC CAG TCT GA-3’；內參GAPDH上游引物：5’-GGG AAG GTG AAG GTC GGA GT-3’，下游：5’-GGG GTC ATT GAT GGC AAC A-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

5. 蛋白質印跡法：收集各組對數生長期細胞，提取各組細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各組蛋白調整同一濃度，檢測細胞內Spry2蛋白表達。兔抗人Spry2、GAPDH一抗稀釋濃度為1∶1 000，羊抗兔二抗稀釋濃度為1∶2 000。ECL法顯影并保存圖像。應用Image J軟件進行分析。以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示目的蛋白表達量。

6. CCK-8細胞增殖實驗：取各組對數生長期細胞并接種于96孔板，培養1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，上酶標儀測定450 nm波長處的各孔吸光度值(A值)。實驗重復3次，取均值。根據實驗數據繪制生長曲線圖。

7. 細胞遷移實驗：取各組對數生長期細胞接種于6孔板，當細胞長滿后，使用200 μL移液器吸頭在細胞層進行劃痕，PBS洗去細胞碎片，倒置顯微鏡下進行拍照(0 h)并記錄拍攝位置。加入無血清培養基繼續培養36 h，倒置顯微鏡下拍照。每組設置3個復孔，重復3次。應用Image J軟件測量長度。

8. 螢光素酶報告實驗：將狀態良好的PANC-1、MIA PaCa-2細胞接種于24孔板，當細胞融合度達50%～70%時，用脂質體LipofectamineTM2000分別將miR-21 mimics或mimics NC與野生型Spry2 3’-UTR報告質粒(Wt-Spry2)或突變型Spry2 3’-UTR報告質粒(Mut-Spry2)共轉染PANC-1細胞，將miR-21 inhibitor或inhibitor NC與Wt-Spry2或Mut-Spry2共轉染MIA PaCa-2細胞，繼續培養36 h后檢測螢光素酶活性。

三、統計學分析

結 果

一、慢病毒轉染后miR-21在胰腺癌細胞中的表達

qRT-PCR法結果顯示，PANC-1細胞轉染miR-21過表達的慢病毒載體(LV-miR-21)后，miR-21表達較對照組明顯上調(P<0.05)(圖1A)；而MIA PaCa-2細胞轉染miR-21敲低的慢病毒載體(SP-miR-21)后，miR-21表達較對照組明顯下調(P<0.01)(圖1B)。

二、MiR-21表達對胰腺癌細胞增殖的影響

CCK-8法結果顯示，miR-21表達上調后PANC-1細胞增殖能力較對照組明顯增強(P<0.05)(圖2A)，而miR-21表達下調后MIA PaCa-2細胞增殖能力較對照組明顯降低(P<0.05)(圖2B)。表明miR-21表達能增強胰腺癌細胞的增殖能力。

三、MiR-21表達對胰腺癌細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗顯示，與對照組相比，miR-21過表達可明顯促進PANC-1細胞遷移(P<0.05)(圖2C)；與對照組相比，miR-21敲低能明顯抑制MIA PaCa-2細胞遷移(P<0.05)(圖2D)。提示miR-21表達能促進胰腺癌細胞遷移。

四、Spry2是miR-21的靶基因

采用預測軟件TargetScan、miRBase、PicTa等進行生物學分析，發現在Spry2 mRNA的3’-UTR含有miR-21結合位點(圖3A)。qRT-PCR和蛋白質印跡法結果表明，與對照組相比，miR-21 mimics組Spry2 mRNA和蛋白表達均明顯下降(P<0.05)，而miR-21 inhibitor組Spry2 mRNA和蛋白表達均明顯上升(P<0.05)(圖3B)。螢光素酶報告實驗顯示，同時轉染miR-21 mimics和Spry2野生型質粒后，螢光素酶活性較對照組明顯降低(P<0.05)，同時轉染miR-21 inhibitor和Spry2野生型質粒后，螢光素酶活性較對照組明顯增強(P<0.01)，而突變組中螢光素酶活性差異均無統計學意義(P>0.05)(圖3C)。說明miR-21可直接靶向調控Spry2表達。

A：PANC-1細胞中miR-21表達；B：MIA PaCa-2細胞中miR-21表達

圖1慢病毒轉染后miR-21在胰腺癌細胞中的表達(qRT-PCR法)

A：miR-21過表達促進PANC-1細胞增殖；B：miR-21敲低抑制MIA PaCa-2細胞增殖；C：miR-21過表達促進PANC-1細胞遷移；D：miR-21敲低抑制MIA PaCa-2細胞遷移

圖2 miR-21表達對胰腺癌細胞增殖、遷移的影響

A：生物信息學軟件預測miR-21與Spry2的結合位點；B：miR-21上下調后對Spry2 mRNA和蛋白水平的影響；C：螢光素酶報告實驗結果

圖3 Spry2是miR-21的靶基因

五、Spry2對miR-21介導的細胞增殖、遷移能力的影響

在PANC-1細胞中，與LV-miR-21+EV組相比，LV-miR-21+Spry2組細胞增殖、遷移能力明顯降低(P<0.05)(圖4A)；在MIA PaCa-2細胞中，與SP-miR-21+Si-NC組相比，SP-miR-21+Si-Spry2組細胞增殖、遷移能力明顯增強(P<0.05)(圖4B)。

討 論

胰腺癌具有高度侵襲性，預后極差，發病率接近于死亡率[7]。近年來，胰腺癌發生率和死亡率逐年上升，預計在2030年將成為癌癥相關死亡的第二大常見原因[8]。目前已發現大量信號通路、生長因子、原癌基因、抑癌基因等參與胰腺癌的發生和發展[9]，但仍未發現有效的治療措施。有研究表明，miRNAs參與腫瘤細胞的增殖和分化，調控腫瘤細胞的侵襲和轉移[10-11]，有望成為腫瘤診斷和治療的靶點。

A：Spry2逆轉miR-21誘導的細胞增殖、遷移；B：Si-Spry2促進細胞增殖、遷移

圖4 Spry2對miR-21介導的細胞增殖、遷移能力的影響

MiR-21在幾乎所有惡性腫瘤中異常表達，并參與腫瘤的形成和進展。在結直腸癌中，miR-21通過轉錄后調控抑制抑癌基因Pdcd4表達而促進腫瘤細胞侵襲和轉移[12]。在乳腺癌細胞中，miR-21通過調節凋亡蛋白Bcl-2表達而抑制癌細胞的凋亡，促進腫瘤形成[13]。大量研究顯示，miR-21在胰腺癌中的表達升高[14-15]，且與胰腺癌的化療抵抗密切相關，下調miR-21表達可增強胰腺癌細胞對化療藥物吉西他濱的敏感性[16-17]。本研究成功構建了以慢病毒介導的miR-21過表達和敲低的穩轉株。CCK-8和劃痕實驗結果顯示miR-21過表達可促進胰腺癌PANC-1細胞增殖和遷移，而miR-21表達下調能抑制MIA PaCa-2細胞增殖和遷移。

MiRNAs通過調節下游靶基因而發揮生物學作用，一種miRNAs能調控多種靶基因的表達[18]。本研究中，通過生物學信息預測軟件對miR-21的靶基因進行預測，篩選出Spry2作為潛在的目的基因。Spry2是受體酪氨酸激酶信號通路的抑制物[19-20]，能抑制生長因子誘導的細胞增殖和轉移[21]，并作為抑癌基因在多種腫瘤中發揮作用[22]。近期一項研究[23]表明，Spry2在胃癌組織中的表達降低，且與患者的5年生存率呈正相關。Shukla等[24]的研究發現Spry2在慢性淋巴性白血病(CLL)中的表達下調，并通過負反饋調節B細胞受體和MAPK信號通路而促進CLL的發生、發展。本研究中，首先利用TargetScan、miRBase、PicTa等預測軟件篩選出miR-21的靶基因Spry2。隨后qRT-PCR和蛋白質印跡法表明Spry2可能是miR-21的靶基因。螢光素酶報告實驗證實miR-21可與Spry2的3’-UTR結合，并調控Spry2的表達。進一步的細胞實驗結果顯示，Spry2能逆轉miR-21誘導的細胞增殖和遷移。由此可見，miR-21可通過下調Spry2表達來促進腫瘤細胞增殖和遷移。

綜上所述，本研究結果證實了miR-21能通過靶向調節Spry2表達而影響胰腺癌細胞的生物學功能，有望為胰腺癌的診斷和治療提供更廣闊的前景。