二仙膏聯合胰激肽原酶對重度少精子癥患者精子質量及ICSI結局的影響*

張新東 金保方 李曉琴 孫大林 楊文濤 李群生 劉建國 趙紅樂

1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖中心（南京 210008）；2.東南大學附屬中大醫院中西醫結合男科；3.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院男科；4.陜西省中醫醫院男科

隨著體外受精胚胎移植（IVF-ET）技術的發展，精液常規參數已經不足以準確評價男性的生育能力。卵胞漿內單精子顯微注射 （intracytoplasmic sperm injection,ICSI）技術的出現，使得對精子密度的要求下降，精液常規參數對ICSI結局的預測價值有局限性。近年來，許多研究認為精子DNA碎片指數（DNA fragmentation Index,DFI）可以更客觀，更準確的評估男性生育能力，對預測IVF-ET的結局具有重要的參考價值[1]。

由于精子DNA損傷的病因及機制至今沒有完全闡明，目前，對于DFI增高還缺乏特異性的治療手段。大量研究表明，睪丸微循環障礙是精子發生異常的病理基礎和病機之一[2]，由于代謝不良，超氧自由基異常增加，精子DNA遭受氧化應激損傷。臨床上我們應用能夠補腎抗氧化作用的中藥二仙膏聯合具有改善微循環的胰激肽原酶（怡開），治療DFI增高的重度少精子癥患者，取得了較好的臨床效果，可以顯著降低DFI，而且在進行ICSI助孕后，可以顯著增加優質胚胎數，改善妊娠結局。現報告如下。

臨床資料及方法

一、研究對象

本研究由東南大學附屬中大醫院、南京大學醫學院附屬鼓樓醫院、廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院、陜西省中醫醫院多中心搜集2018年3月～2019年3月因男方重度少精子癥而擬行ICSI助孕的患者，采用流式細胞儀檢測DFI參數，DFI異常增高者作為研究對象。納入標準：（1）婚后未避孕1年以上未育擬行ICSI治療者；（2）精子濃度≤5×106/mL；（3）DFI≥20%；（4）女方（配偶）年齡≤38歲，且卵巢功能（生殖內分泌、基礎卵泡計數）、子宮及內膜基本正常或者是單純因輸卵管梗阻因素不孕者。

排除標準：（1）男方染色體異常或精子發生基因缺失者；（2）男方年齡≥50歲；（3）男方有乙肝、生殖器皰疹等傳染性疾病患者；（4）男方有前列腺炎、尿道炎、精囊炎等泌尿生殖系統感染患者；（5）男方接觸輻射或高溫工作環境患者；（6）男方有精索靜脈曲張的患者。

二、分組及治療方法

采用分層隨機數字表法，將患者分為觀察組和對照組。觀察組80例口服二仙膏（山東廣育堂國藥有限公司），20g/次，2次/d，同時加服怡開（胰激肽原酶，常州千紅生化制藥股份有限公司）240U/次，3次/d；對照組60例口服維生素E（VE）（青島雙鯨藥業有限公司）100 mg/次，3次/d。研究開始前，征得患者的知情同意權。兩組患者每治療一個月，復查一次精液常規參數及DFI，若DFI已經在正常范圍（≤15%），則提前進入ICSI周期。藥物最多服用3個月，觀察并統計最終療效。

三、超排卵方案及胚胎質量評定

所有女性患者均采用GnRH-a長方案，于降調理想后，注射促性腺激素（Gn，果納芬），取卵后3～4h手淫排精，優化精子后行ICSI，受精后72h后進行胚胎形態學評估，選擇1～2個胚胎進行移植，剩余胚胎冷凍保存。

胚胎質量評定標準：Ⅰ級：胚胎卵裂球大小均勻，透明帶完整，胞質碎片≤5%，胞質均勻透明。Ⅱ級：卵裂球大小稍不均勻，胞質碎片5%～20%，胞質存在少量空泡。Ⅲ級：卵裂球大小明顯不均勻，形狀不規則，胞質碎片20%～50%，可能存在胞質顆粒不均或大量空泡。Ⅳ級：卵裂球大小嚴重不均勻，胞質碎片＞50%，存在胞質顆粒不均或大量空泡。其中Ⅰ-Ⅱ級為優質胚胎，Ⅰ-Ⅲ級為可移植胚胎，Ⅳ級為不可移植胚胎。

四、觀察指標及數據分析

檢測并記錄兩組患者治療前后精液常規參數及DFI值，分別進行組內及組間對比，分析藥物治療效果。進行ICSI助孕后，記錄兩組患者受精率、優胚率及臨床妊娠成功率，分析藥物對妊娠結局的影響。

妊娠結果判定：胚胎移植14d，HCG升高者（＞10mIU/mL）為生化妊娠，移植4周，B超檢查顯示胎心搏動者確認為臨床妊娠。如果懷孕，隨訪至胎兒出生。

五、統計學方法

采用SPSS 24.0統計軟件，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前后組內比較采用配對樣本t檢驗。計數資料采用卡方檢驗，累計頻數＜5時，采用Fisher精確概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般資料對比

兩組患者年齡、治療前精液常規參數、DFI值以及女方（配偶）年齡、基礎卵泡（Antral Follicle Count,AFC）計數比較均無統計學差異（P＞0.05，表1）。

表1 兩組患者一般資料對比

二、治療前后精液參數及DFI比較

觀察組80例患者治療期間脫落5例，對照組60例患者脫落4例。觀察組治療后，精子濃度及活力都有顯著提升，對照組治療前后，精子濃度及活力無明顯變化。觀察組 DFI值由治療前的39.16±11.52降低至9.86±7.32，組內比較有統計學差異（P＜0.05）；對照組 DFI由治療前的39.35±11.62降低至23.54±9.12；觀察組與對照組相比，治療后 DFI參數（9.86±7.32 vs 23.54±9.12）有顯著性差異（P＜0.01，表2）。就治療效率來講，觀察組有34.7%（26例）患者在治療1個月后DFI恢復正常（＜15%），而對照組在治療1個月后僅有14.3%（8例）的患者恢復正常。這說明二仙膏聯合怡開的治療效率比VE更加高效，這也為患者盡快進入ICSI周期爭取了時間。

表2 治療前后精子質量對比

三、患者配偶獲卵數、優胚數及臨床結局比較

兩組患者均采用ICSI助孕治療，配偶獲卵數、受精率無顯著性差異。觀察組優胚率顯著高于對照組，分別為 5.72±1.45、3.16±1.58，兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。臨床妊娠率比較，觀察組和對照組分別為65.3%，60.7%，兩組對比差異無統計學意義（P＞0.05）。從臨床結局來看，觀察組流產3例，對照組流產6例，兩組對比有統計學差異（P＜0.05，表3）。

表3 配偶獲卵數、優胚數及臨床結局

討 論

精子DNA損傷程度（DFI）是評價精液質量和預測男性生育能力的重要指標，生殖系統疾病、環境污染、年齡、藥物、感染、吸煙、放化療、睪丸溫度升高等均可造成精子DNA損傷。精子DNA完整性對于父系基因遺傳給子代至關重要，如果進入卵細胞的精子DNA受損會影響胚胎的發育潛能、胎兒的生長發育等。精子DNA損傷可能與受精率、胚胎發育、種植率、妊娠率、流產率以及子代的先天性異常等有關[3]。

目前關于精子DNA損傷的病因依然沒有完全清楚，但是普遍認為各種因素導致的睪丸損傷（比如精索靜脈曲張、睪丸炎和睪丸外傷等），其最終的病理特征均表現為睪丸微循環障礙。由于代謝不良，超氧自由基異常增加，而氧自由基介導的氧化應激反應在精子DNA損傷過程中起著關鍵作用[4]。精子細胞膜富含多聚不飽和脂肪酸，易受到活性氧自由基（reactive oxygen Species,ROS）攻擊并引起脂質過氧化反應。精子膜的流動性和完整性受到不同程度的損傷，導致精子核DNA變性或者斷裂。同時ROS攻擊精子核內DNA，使其不能正常包裝和修復，導致DNA斷裂、堿基修飾及染色質交聯異常。

針對DFI異常增高，目前還沒有推薦性的治療藥物。根據精子DNA損傷發生的過程，可以推斷睪丸微循環障礙以及氧化應激損傷可能是精子DNA碎片增加的主要發生機制，而改善微循環已經被作為男性不育的基礎性治療方法寫入中華醫學會男科學分會 《中國男科疾病診斷與治療指南（2016版）》。據此，我們在臨床運用補腎養血抗氧化及改善睪丸微循環的治療理念，聯合使用二仙膏（補腎養血抗氧化）和胰激肽原酶（改善微循環），降低ICSI患者的DFI參數，探討這種治療方法的有效性，為臨床治療DFI異常增高，提供一種診療思路和行之有效的方案。

中醫學認為“腎藏精，主生殖”、“精血同源”，并在男子不育癥的治療方面，積累了豐富的經驗。目前認為補腎養血中藥一般都具有抗氧化及延緩衰老的作用[5]。二仙膏是在著名古方龜鹿二仙膏基礎上加味制備而成，已成功申請國家非物質文化遺產。龜鹿二仙膏首見于《醫方考·虛損勞瘵門》，由鹿角、龜板、枸杞子、人參四味中藥組成。此方以溫腎益精的鹿角與滋陰補血的龜板二藥作為主藥，輔以補益生津的枸杞子和人參，四藥合用，性味平和。其功能主治為：“男婦真元虛損，久不孕育；男子酒色過度，消爍真陰，婦人七情傷損血氣，諸虛百損，五勞七傷。”二仙膏在此基礎上加入熟地黃、何首烏、沙苑子、山藥、黃芪、五味子、遠志、牛膝、丹參、核桃仁、牛鞭、黑芝麻，增強了補腎填精功效，并通過益氣養血，達到精血互補的作用。前期的研究表明[6]，二仙膏可以通過提高免疫細胞因子的表達，改善機體的免疫功能，而機體的免疫功能和氧化應激密切相關，共同維護人體的內環境穩態。在炎癥過程中，免疫細胞產生一系列的炎癥因子如細胞因子和反應性ROS對于消除病原是非常關鍵的，但過量ROS氧化血清白蛋白，進而誘導自身抗體合成，引發系統功能紊亂，產生疾病。某些細胞因子還可抑制氧化應激，如TNF-α激活NF-κB，上調錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和鐵蛋白重鏈（FHC）表達，清除過量 ROS，這是 ROS 和 NF-κB 交聯調控免疫系統和氧化應激的重要途徑[7]。現代藥理學研究也表明[8-10]，二仙膏中的多種成分均有抗氧化作用。

胰激肽原酶（pancreatic kininogenase）又稱胰激肽釋放酶、血管舒緩素，是激肽系統的一個重要組成部分，屬蛋白水解酶類，具有擴張毛細血管，增加毛細血管血流量，改善微循環和器官代謝的作用。胰激肽原酶廣泛存在于生殖系統的各種組織和體液中，通過刺激前列腺素PGE2的生成，增加睪丸和附睪的血流量[11]，改善末梢血液循環，從而抑制氧化應激，減少ROS的產生[12]；此外，通過增加睪丸的血流量，改善生精小管的管狀結構和間質組織的營養，刺激Sertoli細胞的生長，促進睪丸組織核酸的合成，為精子發生提供理想的生精微環境[13,14]。

鑒于此，本研究聯合使用二仙膏和怡開，治療DFI增高的重度少精子癥患者，結果發現，治療后觀察組精子濃度明顯升高，精子DFI值顯著下降，與對照組相比差異具有統計學意義。就時間效率而言，觀察組的治療效果更快，有34.7%的患者，在服用藥物1個月后，DFI即恢復正常，為患者進入ICSI周期節約了時間成本。

患者經過ICSI助孕后觀察其結局，結果發現，在配偶獲卵數相似的情況下，觀察組優胚率明顯高于對照組。臨床妊娠率比較，觀察組高于對照組，但無統計學差異。盡管兩組患者的臨床妊娠率差別不大，但是考慮到鮮胚移植的妊娠率僅有60%左右，以及部分患者有再次生育的需求，那么觀察組擁有更多優質胚胎，為下次移植及再次生育做好了胚胎儲備。就最終妊娠結局而言，觀察組流產3例（4.0%），對照組流產6例（10.7%），觀察組有更好的臨床結局。

總之，本研究的結果表明，通過改善睪丸微循環和補腎抗氧化治療可以顯著降低不育癥患者精子DNA碎片率，增加優胚率，有利于IVF結局。因此，這一診療理念值得臨床推廣應用，并且迫切需要對其作用機制進行進一步深入研究。