消化道真菌在克羅恩病中的研究進展*

尹 娟 龐 智

南京醫科大學附屬蘇州醫院消化系疾病與營養研究中心(215008)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)，其發病機制復雜，病因學不明，目前普遍認為環境、微生物等因素誘導遺傳易感個體的腸道對微生物產生異常免疫應答導致的慢性炎癥與IBD發病有關。遺傳易感無菌動物并不表現出結腸炎癥狀，表明微生物是IBD發生的必要條件[1]。隨著二代測序技術的發展，近年涌現出大量研究應用16S宏基因組測序分析CD患者消化道中復雜的微生物組成和菌群失調現象。同時，關于真核生物中的機會致病真菌與IBD發病和慢性化相關的報道也日益增多。與非CD患者相比，CD患者的抗真菌抗體水平更高，甚至在疾病確診前即已表現出差異[2-3]，支持這一群體存在真菌菌群失調的觀點。本文重點從病原學和宏基因組學角度綜述近期真菌在成人CD患者中的研究進展。

一、腸道真菌與宿主免疫系統的關聯

腸道真菌種類受宿主遺傳背景、衛生狀況、生活方式、抗菌藥物的使用等多種因素影響，最常出現于人體腸道的真菌為青霉屬、念珠菌屬和曲霉屬[4]。研究[5]表明食物來源對腸道真菌菌群組成有顯著影響，主食動物性食物與主食植物性食物的人群腸道真菌菌群差異顯著。盡管在DNA水平檢測，真菌菌群在腸道微生物中的占比僅約0.1%～1%，但其平均體積為細菌的100倍以上，腸道真菌的生物總量及其對腸道微生態的作用可能被大大低估[6]。

定植于腸道的真菌與宿主免疫系統間的相互作用對維持宿主腸道健康極為重要。固有免疫受體如C型凝集素受體(dectin-1、dectin-2、mincle等)、Toll樣受體(TLR2、TLR4等)可識別真菌胞壁β-1,3-葡聚糖。Dectin-1可通過CARD9激活細胞內信號，誘導T細胞向Th1、Th17細胞分化以及相關炎癥細胞因子產生[7]；通過與腸道微生物間的作用調控調節性T細胞(Treg細胞)分化，從而調節腸道免疫穩態[8]。關于真菌通過C型凝集素受體在IBD中作用的研究較為多見。Dectin-1缺失小鼠對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的結腸炎更為敏感；dectin-1基因多態性(CLEC7A)與UC病情重癥化顯著相關[9]。高表達dectin-1以及其他C型凝集素受體的CX3CR1+單核吞噬細胞可應對多數共生真菌，通過Syk信號通路啟動適應性抗真菌免疫應答，該細胞功能受損的小鼠更易被念珠菌屬誘導發生腸道疾病；CD患者存在CX3CR1編碼基因錯義突變，并與抗真菌應答受損相關[10]。因此，腸道真菌菌群穩態與腸黏膜免疫平衡密切相關。

二、二代測序技術的發展對腸道真菌微生態研究的促進作用

近20年來，不依賴于培養法的二代測序技術的發展使研究消化道中難以培養的微生物成為可能。對真菌的分析系針對其高度保守的內部轉錄間隔區(ITS1或ITS2)。不同測序平臺使用的策略各有其優勢。Illumina測序平臺使用的循環可切除終止測序法策略同聚體錯誤率低；454焦磷酸測序法可測序1 000 bp的長片段，解除了測序的長度限制；而SOLiD(sequencing by oligonucleotide ligation and detection，寡核苷酸連接和檢測測序)方法使大規模平行測序成為可能。Illumina測序的準確性大于99.5%，其他連接酶法測序如SOLiD準確性大于99.95%[11]。研究者可根據實驗需求選擇合適的測序平臺。

運算軟件的不斷發展，使計算出差異小于1%的OTU(operational taxonomic units，運算分類單位)成為可能，MED(minimum entropy decomposition)還可分辨近緣物種的真正差異和測序誤差[12]。生態學分類概念被用于區分微生物種群，如alpha多樣性分析的shannon和simpson指數被用于計算樣本內物種多樣性，而beta多樣性分析可評估樣本間多樣性。未來16S與ITS測序策略的整合，加之對復雜的細菌與真菌混合群體數據分析方法的發展，將促進對真菌在健康和疾病中所起作用的評估工作[13]。

三、真菌在CD發病機制中的作用

應用二代測序技術檢測CD發病過程中的腸道菌群組成，可發現患者腸道細菌與真菌菌群組成多樣性相關，細菌與真菌菌群失調亦相關[13-14]。與健康對照者相比，CD患者結腸活檢標本的真菌菌群生物多樣性更大[15]，炎癥黏膜真菌豐度和生物多樣性增加更為顯著[16]；糞便真菌菌群中白念珠菌、棒曲霉、新型隱球菌數量顯著增多，且糞便真菌生物多樣性與血清C反應蛋白(CRP)和CD活動指數呈顯著正相關[16]。Hoarau等[17]發現，CD患者與其無病一級親屬相比，熱帶念珠菌豐度顯著增高，并與CD生物學標志物抗釀酒酵母抗體(ASCA)水平呈正相關，但真菌總體生物多樣性減少。Sokol等[18]分析了IBD患者的糞便樣本，發現其擔子菌門/子囊菌門比值較健康個體升高，釀酒酵母占比降低，白念珠菌占比增高。Liguori等[19]的研究顯示，CD患者黏膜相關菌群中銀耳亞綱Cystofilobasidiaceae科家族和光滑念珠菌過量，炎癥黏膜真菌總體數量增多，炭角菌目存在于炎癥黏膜，釀酒酵母和指甲絨黑粉類酵母則存在于非炎癥黏膜。這些真菌只是路過菌還是與腸黏膜免疫相關，亟待深入研究。但上述研究均支持成人CD患者腸道真菌生物組成豐度大于健康人群的觀點。

人體內真菌生態失調與內穩態是一個動態過程，這一動態變化很可能比真菌感染更常發生，從而對宿主免疫系統產生持續影響[20-21]。近期研究表明共生真菌白念珠菌和釀酒酵母可馴化宿主免疫系統，該作用與真菌胞壁多糖幾丁質有關。分離自白念珠菌的幾丁質可通過促進巨噬細胞分泌抗炎細胞因子白細胞介素-10(IL-10)抑制炎癥反應[22]。以釀酒酵母幾丁質預處理小鼠，可誘導小鼠對抗白念珠菌引起的致命感染；經特定釀酒酵母菌株處理的人單核細胞，由脂多糖(LPS)刺激引起的促炎細胞因子IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌增多，殺菌能力增強；分離自CD患者糞便樣本釀酒酵母的幾丁質含量顯著高于環境中釀酒酵母的幾丁質含量，可能在腸黏膜促炎細胞因子分泌中起調控作用[23]。

共生真菌在淋巴細胞再循環和誘導宿主免疫耐受中發揮重要作用。人類出生后RALDH+樹突細胞(DCs)從固有層被招募至腸系膜和外周淋巴結的過程依賴于共生真菌。以抗真菌藥物處理SPF級小鼠，可導致其外周淋巴結中的RALDH+DCs顯著減少；而予小鼠外源性熱帶念珠菌可增加其外周淋巴結中的RALDH+DCs數量[24]。由此推測生命早期腸道微生物群對免疫系統的發育至關重要。有研究[25]報道，健康人群外周血中存在真菌特異性Treg細胞擴增，其表型和功能特征均與胸腺來源的Treg細胞相同。小鼠小腸派伊爾結DCs識別白念珠菌誘導免疫耐受，此過程依賴于真菌誘導產生的2,3吲哚胺雙加氧酶(2,3 indoleamine dioxy-genase， IDO)[26]。免疫耐受DCs產生的IDO促進色氨酸代謝成為活化T細胞芳烴受體的底物，從而促進Treg細胞產生[20，27]。根據上述結論推測，CD患者白念珠菌等共生真菌比例變化可調控外周血Treg細胞數量和免疫耐受。

目前對真菌在IBD發病中的作用機制并不明確，但研究[9]證實dectin-1基因與UC疾病嚴重程度相關，dectin-1缺失小鼠對實驗性結腸炎易感。CD患者抗真菌抗體水平升高，ASCA IgG和IgA被認為是CD診斷和疾病進程預測較好的生物學標志物[2-3]。基于全基因組關聯分析的研究[28]發現IBD與宿主抗真菌免疫相關。鑒于成人CD患者存在明顯的真菌菌群失調，共生真菌對腸黏膜免疫系統具有重要調節作用，生命早期免疫系統發育受真菌影響顯著，因此易感個體童年期真菌菌群組成對生命后期疾病風險的評估具有重要意義。亟待開展更多基礎和轉化研究深入探索真菌菌群失調與CD發展間的因果關系。

四、CD患者腸道真菌菌群失調與現行治療方案的關系

現行CD早期有效治療方案為使用抗體靶向特定炎癥相關分子以減輕慢性炎癥，TNF-α、IL-12/23和白細胞黏附分子為常用治療靶點。靶向TNF-α的抗體主要有英夫利西單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗，優特克單抗則是首個靶向IL-12/23 p40亞基的抗體。條件致病真菌如白念珠菌相關免疫反應有TNF-α、IL-17、IL-23等參與[29-30]。因此上述CD治療方案與真菌感染(組織胞漿菌病、酵母菌病、球孢子菌病以及其他機會致病真菌感染)有關[31]。臨床試驗中，與安慰劑相比，抗IL-17A單抗(蘇金單抗)治療組患者糞便炎癥介質增多，發生黏膜皮膚念珠菌病的風險增加[32]。納入14篇文獻共1 524例IBD患者的系統綜述表明，IBD患者最常見的真菌感染為念珠菌屬感染(903例)，多數感染發生于抗TNF-α治療6個月內[33]。

迄今尚無IBD抗真菌治療的臨床試驗開展。理論上，靶向IL-17、IL-23、IL-22、TNF-α細胞因子途徑可減輕促炎反應和急性黏膜損傷，但也同時導致共生真菌減少，機會致病真菌豐度增加，這為IBD患者臨床檢測到病原真菌提供了合理的解釋。特別是Th17細胞因子，如IL-22可直接調節上皮抗微生物相關基因表達，包括腸上皮細胞Reg3γ以及Paneth細胞等的抗微生物產物。這些黏膜分泌物減少可促進黏膜表面真菌生長和定植。雖然上述現象并未被常規檢測到，但已有研究數據表明某些免疫靶向治療可致真菌負荷增加。由此可提出下述假設：IBD相關免疫反應部分是由病原真菌所驅動，特定治療方案可能緩解消化道對病原真菌的免疫反應[13]。

五、益生真菌在IBD治療中的應用

共生真菌對宿主免疫功能具有重要調節作用。目前在CD的臨床治療中，布拉酵母菌已被用于緩解腸道炎癥的輔助治療。近年來，其機制研究取得了一定進展。作為一種益生真菌，布拉酵母菌可增強宿主腸道對病原菌的免疫反應，限制CD、UC以及難辨梭菌結腸炎等病理性炎癥反應[34]。布拉酵母菌培養上清液可直接抑制CD患者由LPS誘導的髓樣DCs及其促炎細胞因子分泌[35]。有研究[34]發現，布拉酵母菌可提高腸道總IgA水平。在小鼠結腸炎模型中，喂飼布拉酵母菌可減輕組織學炎癥反應，抑制白念珠菌在腸道定植[36]。

另一見諸報道的益生真菌為乳酒假絲酵母。口服乳酒假絲酵母可緩解實驗性結腸炎，伴腸系膜淋巴結Treg細胞和調節性DCs增多以及固有層Th17細胞減少[37]。隨著高通量二代測序技術的發展，未來研究或可關注腸黏膜或糞便樣本菌群分析中益生真菌的鑒定及其臨床應用。

六、糞菌移植(FMT)與IBD

FMT最早系用于治療復發性難辨梭菌感染，可重建腸道菌群內穩態[38]。目前關于FMT在IBD治療中的應用已成為研究熱點，但結論不一。一項關于FMT治療IBD的系統綜述顯示，17.4%～60.4%的IBD患者經FMT治療后獲得臨床緩解，UC患者和CD患者的臨床緩解率分別為22%和60.5%[39]。目前關于FMT用于UC患者的研究更多。最近一項多中心、雙盲、隨機、安慰劑對照試驗表明，多供體FMT可誘導活動性UC臨床緩解和內鏡改善，FMT后微生物多樣性增加并持續[40]。當前關于FMT供體與受體糞便微生態的研究聚焦于細菌組成，尚無研究關注真菌組成在FMT治療前后微生物多樣性變化中的貢獻。隨著真菌菌群分析方法的改進，真菌分析將在分析FMT供體與受體腸道微生態變化中占據重要地位。

七、小結與展望

IBD病因學研究強烈支持如下觀點：環境因素的改變可影響宿主腸道微生態，增加遺傳易感宿主的IBD發生風險，繼而影響疾病進展。現有研究多聚焦于細菌菌群失調在IBD發病中的作用，但越來越多的研究數據表明真菌菌群組成在此過程中亦發生顯著變化，消化道中存在著更為復雜的微生態環境成分的相互作用。綜上所述，人類消化道中真菌菌群多樣性的改變以及特定真菌種類豐度的變化在IBD發病中起有一定作用，未來IBD相關研究應更加關注真菌在IBD病因中的潛在作用。