集束化療法對(duì)C PR兔心臟保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

劉鳳艷 ，張 欣 *，梁建慶 ，胡 蓉 ，杜雪洋 ，王 鑫

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州730000）

本研究觀察心搏驟停（CA）模型兔心肺復(fù)蘇（CPR）后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、腦鈉肽（BNP）、氧化應(yīng)激指標(biāo)、cTnI、CK、CK-MB、LDH的變化，為CA后的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

肝素（天津生化制藥有限公司，6.25 kU/ml，批號(hào)：H18030914）；鹽酸腎上腺素（上海禾豐制藥有限公司，1 mg/ml，批號(hào)：181108）；黃芪注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，每支10 ml，相當(dāng)于原藥材20 g，批號(hào)：1812062）；戊巴比妥鈉（上海中西藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：WS20180920）；氨基甲酸乙酯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180125）。

兔BNP（批號(hào)：H166）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒，丙二醛（MDA，批號(hào)：A003-1）測(cè)定試劑盒，谷胱甘肽（GSH，批號(hào)：A006-2）測(cè)定試劑盒，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px，批號(hào)：A005）測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)：A001-3）檢測(cè)試劑盒，CK（批號(hào)：A032）測(cè)定試劑盒，CK-MB（批號(hào)：E006）測(cè)定試劑盒，LDH（批號(hào)：A020-2）測(cè)定試劑盒，cTnI（批號(hào)：E019）測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DHX-300動(dòng)物呼吸機(jī)、RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)、YP100型壓力傳感器、YPJ01型壓力換能器（均為成都儀器廠生產(chǎn)）；聚乙烯醫(yī)用塑料心臟導(dǎo)管、動(dòng)脈導(dǎo)管（成都泰盟科技有限公司，外徑2.0 mm，內(nèi)徑1.5 mm）；T型套管；家兔實(shí)驗(yàn)臺(tái)；常用實(shí)驗(yàn)器械；肛溫表；聯(lián)想微型計(jì)算機(jī)；健源注射泵（JZB-1800）；高速冷凍離心機(jī)（Multifuge IS-R，德國(guó) THERMO公司）；Biotek Synergy2多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)基因有限公司生產(chǎn)）；電熱恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備[1]

選擇24只日本大耳白兔，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（甘）2015-0003。采用隨機(jī)數(shù)字表法將白兔分為假手術(shù)組、腎上腺素組、亞低溫組及集束化治療組，每組6只。耳緣靜脈注射25%烏拉坦4 ml/kg麻醉動(dòng)物（必要時(shí)可追加），無(wú)菌操作下分離氣管，切開氣管插入T型套管，分離左頸總動(dòng)脈、左股動(dòng)脈與右頸靜脈。經(jīng)左頸總動(dòng)脈插入心臟導(dǎo)管至左心室，連接RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)；左股動(dòng)脈插入動(dòng)脈導(dǎo)管，連接生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓（MAP）。體外電擊誘發(fā)心室纖顫（室顫）動(dòng)物模型，50 V交流電持續(xù)放電30 s，監(jiān)護(hù)儀顯示出現(xiàn)室顫波及MAP＜20 mmHg持續(xù)3 min表示動(dòng)物模型制備成功。

集束化治療組術(shù)后立即開始CPR、胸外按壓（按壓頻率200次/min，按壓深度為兔胸廓前后徑的1/3）與機(jī)械通氣（吸入氧氣濃度為1 L/min，通氣頻率45次/分鐘，潮氣量15 ml/kg），并經(jīng)右頸靜脈泵入腎上腺素30 μg/kg和黃芪注射液4 g/kg。復(fù)蘇2 min后若仍為室顫則給予30 J單相波電除顫，之后持續(xù)胸外按壓2 min，如仍為室顫再以同樣能量電除顫，如此反復(fù)3次為一個(gè)周期。15 min后自主循環(huán)仍未恢復(fù)視為復(fù)蘇失敗。若出現(xiàn)室上性自主心律、MAP≥60 mmHg并持續(xù)5 min則表示自主循環(huán)恢復(fù)（ROSC），復(fù)蘇成功。ROSC后快速誘導(dǎo)亞低溫并維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

假手術(shù)組不進(jìn)行體外電擊致顫，不靜脈給藥，不實(shí)施亞低溫療法。腎上腺素組僅給予腎上腺素復(fù)蘇。亞低溫組除不給予黃芪注射液外，其余處理同集束化治療組。所有操作按照Utstein動(dòng)物模型復(fù)蘇指南[2]進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 亞低溫療法

用輸液泵從白兔耳緣靜脈以1.0 ml/kg·min速度泵入4℃的0.9%氯化鈉注射液，同時(shí)配合體表降溫（將碎冰置于中空手術(shù)臺(tái)內(nèi)，冰量按體質(zhì)量給予100 g/100 mg）[3]。10～15 min內(nèi)白兔肛溫降至目標(biāo)溫度（32℃～34℃），達(dá)到目標(biāo)溫度后停止泵入4℃的0.9%氯化鈉注射液，繼續(xù)體表降溫維持目標(biāo)溫度。亞低溫誘導(dǎo)過(guò)程中若白兔出現(xiàn)寒戰(zhàn)，可解除體表降溫，待寒戰(zhàn)反應(yīng)逐漸消失后，依據(jù)監(jiān)測(cè)溫度調(diào)節(jié)體表降溫冰量，確保模型組白兔體溫波動(dòng)在目標(biāo)范圍內(nèi)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

復(fù)蘇后觀察4 h，記錄一般情況，腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）處死白兔。

1.5.1 左室舒張期末壓（LVEDP）、左室內(nèi)壓上升/下降最大速率（±dp/dt max）及MAP 于致顫前15 min和復(fù)蘇后30、60、120、180、240 min使用RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)測(cè)定LVEDP、±dp/dt max及MAP。

1.5.2 BNP[4]分別于致顫前15 min和復(fù)蘇后30、180、240 min采集動(dòng)脈血1.5 ml，離心10 min分離血清，儲(chǔ)存于-20℃待測(cè)。采用ELISA檢測(cè)BNP水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)[5]復(fù)蘇后觀察4 h，處死白兔，摘取心肌組織，取適量上清液進(jìn)行丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5.4 cTnI、CK、CK-MB、LDH 指標(biāo)[6]復(fù)蘇后觀察 4 h，處死白兔，立即采集右頸靜脈血 5 ml，測(cè)定 cTnI、CK、CK-MB、LDH，采用ELISA法檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前情況

24只白兔全部誘發(fā)CA，成功復(fù)蘇并觀察240 min。4組動(dòng)物的基本生理參數(shù)、體質(zhì)量、麻醉藥物用量、手術(shù)時(shí)程等比較均無(wú)明顯差異，具有可比性。

2.2 4組CPR前后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化（見表1）

致顫前4組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)腎上腺素組、亞低溫組及集束化治療組LVEDP均較假手術(shù)組明顯升高；集束化治療組復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)LVEDP明顯低于腎上腺素組和亞低溫組（均P＜0.01）；腎上腺素組、亞低溫組和集束化治療組復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)±dp/dt max及MAP均低于假手術(shù)組；集束化治療組復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)±dp/dt max及MAP明顯高于腎上腺素組和亞低溫組（均P＜0.01）。

2.3 4組CPR前后BNP變化（見表1）

致顫前，4組BNP比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)腎上腺素組、亞低溫組和集束化治療組BNP高于假手術(shù)組，集束化治療組復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)BNP明顯低于腎上腺素組和亞低溫組（均P＜0.01）。

表1 4組心肺復(fù)蘇前后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化（±s）

表1 4組心肺復(fù)蘇前后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與同期腎上腺素組比較，bP＜0.01；與同期亞低溫組比較，cP＜0.01

組別時(shí)間（m i n）+d p/d t m a x（m m H g/m s）-d p/d t m a x（m m H g/m s）M A P（m m H g）B N P（n g/L）假手術(shù)組7 7 7 3±2 8 8 5 9 5 3±2 1 1致顫前1 5復(fù)蘇后3 0復(fù)蘇后6 0復(fù)蘇后1 2 0復(fù)蘇后1 8 0復(fù)蘇后2 4 0致顫前1 5復(fù)蘇后3 0復(fù)蘇后6 0復(fù)蘇后1 2 0復(fù)蘇后1 8 0復(fù)蘇后2 4 0致顫前1 5復(fù)蘇后3 0復(fù)蘇后6 0復(fù)蘇后1 2 0復(fù)蘇后1 8 0復(fù)蘇后2 4 0致顫前1 5復(fù)蘇后3 0復(fù)蘇后6 0復(fù)蘇后1 2 0復(fù)蘇后1 8 0復(fù)蘇后2 4 0 L V E D P（m m H g）2.4 2±0.2 2 2.4 4±0.2 3 2.6 4±0.1 5 2.6 8±0.1 5 2.7 0±0.1 4 2.8 0±0.1 6 2.3 9±0.2 3 8.0 0±0.1 8 a 8.8 9±0.1 4 a 7 7 1 8±3 7 5 5 5 6 3±1 8 7 1 4 2±1 3 1 4 5±1 4 7 6 8 7±3 8 6 5 4 7 6±1 9 1 7 6 5 7±3 8 1 5 0 6 5±1 9 4--7 5 3 2±3 2 1 4 7 7 3±1 8 0 6 5 3 5±3 2 2 3 9 7 2±1 7 6腎上腺素組7 6 4 6±3 1 3 5 8 8 1±1 8 5 3 7 6 5±3 0 3 a 2 4 0 5±1 9 8 a 1 4 1±2 0 1 4 8±1 5 1 3 7±1 9 3 4 2±1 5 a 3 5 6 3±1 8 0 a 2 3 8 1±2 5 6 a 1 0.0 2±0.2 1 a 1 1.5 0±0.3 7 a 1 2.4 7±0.3 3 a 2.4 6±0.2 3 5.8 7±0.2 1 ab 6.7 9±0.2 0 ab 7.3 8±0.2 2 ab 8.5 7±0.1 9 ab 9.4 4±0.2 3 ab 2.4 1±0.2 1 2.8 6±0.2 0 abc 3.7 8±0.1 9 abc 4.3 7±0.2 1 abc 5.5 8±0.1 8 abc 6.4 6±0.2 3 abc 2 3 5 6±2 3 4 a 1 9 8 3±3 3 4 a--2 2 7 9±2 0 0 a 1 7 1 2±2 0 1 a 2 0 4 5±3 1 0 a 1 4 1 5±1 8 7 a亞低溫組7 7 5 9±1 7 0 5 6 9 9±2 0 0 5 1 8 8±1 9 3 ab 3 6 5 6±2 6 7 ab 2 9 1±1 5 a 2 8 4±1 4 a 1 4 5±1 3 3 0 3±2 4 ab 4 7 3 7±2 5 4 ab 3 5 7 4±3 5 7 ab 3 5 5 6±2 8 3 ab 3 3 8 9±1 9 1 ab--3 5 2 3±2 2 0 ab 2 7 1 8±2 0 3 ab 3 2 1 4±1 5 7 ab 2 4 5 7±2 4 5 ab集束化治療組7 8 0 0±5 2 0 5 8 5 9±2 5 2 6 2 1 1±1 9 2 abc 5 1 0 4±3 6 8 abc 2 6 4±2 0 ab 2 5 0±2 5 ab 1 4 3±1 2 2 6 4±1 7 abc 5 7 4 7±2 0 4 abc 4 8 7 5±2 9 4 abc 4 8 7 5±1 8 1 abc 4 6 6 7±1 5 4 abc--4 5 7 5±2 2 4 abc 4 1 8 7±1 9 7 abc 4 2 1 9±3 5 2 abc 3 6 8 7±1 6 7 abc 9 6.9 1±1.9 8 9 3.2 1±2.0 5 9 2.0 6±1.8 8 9 0.1 1±1.9 9 8 8.1 0±2.8 3 8 7.1 0±2.8 0 9 5.8 4±2.5 5 5 0.1 6±1.7 8 a 4 8.3 3±1.2 6 a 4 7.5 5±0.9 9 a 4 3.6 0±2.7 8 a 4 4.1 3±1.0 7 a 9 4.6 2±2.8 1 6 3.3 4±2.1 2 ab 6 5.1 4±3.1 7 ab 6 5.2 1±2.6 1 ab 6 0.7 5±2.1 1 ab 5 6.7 7±1.6 0 ab 9 6.9 5±1.8 5 8 8.3 6±1.9 5 abc 8 7.0 3±1.8 3 abc 8 5.0 3±1.8 2 abc 8 3.1 8±1.8 0 abc 8 2.0 1±1.8 0 abc 2 2 6±1 5 abc 1 9 8±1 7 abc

2.4 4組CPR后氧化應(yīng)激指標(biāo)變化（見表2）

表2 4組心肺復(fù)蘇后240 min氧化應(yīng)激指標(biāo)變化（±s）

表2 4組心肺復(fù)蘇后240 min氧化應(yīng)激指標(biāo)變化（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與同期腎上腺素組比較，bP＜0.01；與同期亞低溫組比較，cP＜0.01

組別 G S H（m g/g p r o t）M D A（n m o l/m g p r o t）G S H-P x（U/m g p r o t）S O D（U/m g p r o t）假手術(shù)組腎上腺素組亞低溫組集束化治療組4.2 2±0.2 7 8 8.6 0±3.5 0 2 9.1 1±0.3 8 a 1 6.9 9±0.4 1 ab 1 0.4 6±0.3 2 abc 1 4.6 5±0.4 2 1.0 2±0.3 6 a 2.9 9±0.3 8 ab 8.1 2±0.3 1 abc 2 0.3 1±3.5 6 a 3 9.6 9±3.5 8 ab 5 5.3 4±3.4 1 abc 3 7 4.2 7±6.5 6 6 8.9 4±5.0 4 a 2 2 1.3 2±4.3 2 ab 3 0 1.9 7±5.0 2 abc

復(fù)蘇后腎上腺素組、亞低溫組和集束化治療組MDA高于假手術(shù)組，GSH、GSH-Px、SOD低于假手術(shù)組；集束化治療組MDA明顯低于腎上腺素組和亞低溫組，GSH、GSH-Px、SOD明顯高于于腎上腺素組和亞低溫組（均P＜0.01）。

2.5 4組 CPR 后 cTnI、CK、CK-MB、LDH 比較（見表 3）

表3 4 組心肺復(fù)蘇后 240 min cTnI、CK、CK-MB、LDH 比較（±s）

表3 4 組心肺復(fù)蘇后 240 min cTnI、CK、CK-MB、LDH 比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與同期腎上腺素組比較，bP＜0.01；與同期亞低溫組比較，cP＜0.01

組別 C K（U/L）c T n I（μ g/L）C K-M B（U/L）L D H（U/L）假手術(shù)組腎上腺素組亞低溫組集束化治療組4.0 2±0.2 7 1 9.0 1±0.3 8 a 1 6.2 9±0.4 1 ab 8.3 6±0.3 2 abc 7 4.6 5±3.4 2 2 9 7.0 2±3.3 6 a 2 0 8.9 9±3.3 8 ab 1 0 5.1 2±3.3 1 abc 1 8.6 0±4.5 0 5 0.3 1±3.5 6 a 3 9.6 9±3.5 8 ab 2 5.3 4±3.4 1 abc 1 7 4.2 7±7.5 6 3 6 8.9 4±5.0 4 a 3 0 1.3 2±4.3 2 ab 2 0 1.9 7±5.0 2 abc

復(fù)蘇后腎上腺素組、亞低溫組和集束化治療組cTnI、CK、CK-MB、LDH 高于假手術(shù)組，集束化治療組 cTnI、CK、CK-MB、LDH明顯低于腎上腺素組和亞低溫組（均P＜0.01）。

3 討論

3.1 心臟驟停后綜合征的本質(zhì)是缺血再灌注損傷，臨床無(wú)理想治療方法

心臟驟停后綜合征（PCAS）是指在心跳驟停后經(jīng)過(guò)有效搶救，雖然恢復(fù)了自主循環(huán)（ROSC），但因全身缺血時(shí)間較長(zhǎng)而造成多臟器損傷或在缺血再灌注時(shí)及再灌注之后出現(xiàn)臟器損傷，并導(dǎo)致的一系列病理生理學(xué)改變。PCAS的本質(zhì)是缺血再灌注損傷，是臨床最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致多數(shù)患者死亡或留下嚴(yán)重后遺癥[7]。

3.2 心臟驟停后綜合征西醫(yī)治療效果欠佳，中醫(yī)療效令人鼓舞

令人遺憾的是，目前西醫(yī)對(duì)PCAS的治療效果不容樂(lè)觀，腎上腺素是最常用的藥物。但腎上腺素在發(fā)揮縮血管作用、提高冠脈灌注壓（CPP）、增加ROSC的同時(shí)也因增加耗氧量而無(wú)法改善遠(yuǎn)期預(yù)后[8]。院外患者ROSC后立即靜脈輸注冷液體治療，及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)到急診科ICU應(yīng)用亞低溫技術(shù)（如血管內(nèi)降溫、經(jīng)鼻冷卻和體外包埋降溫等技術(shù)），有望提高出院存活率[9]。因此，亞低溫療法值得進(jìn)一步研究。有研究報(bào)道，用黃芪注射液給大鼠灌胃可明顯改善慢性心衰大鼠心功能，升高±dp/dt max，降低LVEDP水平[10]。黃芪注射液腹腔注射，可改善心衰大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)[11]。基于此，本研究采用黃芪注射液聯(lián)合腎上腺素、亞低溫等集束化治療PCAS，以預(yù)防心肌缺血再灌注損傷。目前研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激損傷也是PCAS腦損傷的重要機(jī)制之一[12-15]。心肌細(xì)胞內(nèi)含有多種酶（cTnI、CK、CK-MB、LDH 等），參與各種生理活動(dòng)。當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生損傷或細(xì)胞膜通透性升高時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)的酶會(huì)釋放入血，因此，臨床上常根據(jù)血清心肌酶的變化判斷心肌損傷程度[16]。

3.3 集束化療法對(duì)PCAS家兔心臟的保護(hù)機(jī)制

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，集束化療法對(duì)PCAS家兔心臟有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善血流動(dòng)力學(xué)有關(guān)[17]。在其療效得到肯定的基礎(chǔ)上，我們擬對(duì)其發(fā)揮作用的分子機(jī)制做進(jìn)一步探討。本研究結(jié)果顯示，復(fù)蘇后集束化治療組各時(shí)間點(diǎn)LVEDP、BNP明顯低于腎上腺素組、亞低溫組，±dp/dt max、MAP明顯高于腎上腺素組、亞低溫組（均P＜0.01），MDA明顯低于腎上腺素組、亞低溫組，GSH、GSH-Px、SOD明顯高于于腎上腺素組、亞低溫組（均P＜0.01），cTnI、CK、CK-MB、LDH 明顯低于腎上腺素組、亞低溫組（均P＜0.01）。表明，集束化療法可明顯改善白兔心功能，優(yōu)化血流動(dòng)力學(xué)、BNP、氧化應(yīng)激及心肌酶學(xué)指標(biāo)，減輕缺血再灌注損傷，發(fā)揮器官保護(hù)作用，值得推廣。