何首烏組培快繁技術研究

倪榮興 陳曉欣 郭梓杰

摘要 ? ?為建立道地種源德慶何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）組培快速繁殖體系，為生產提供優質種苗，本文以何首烏的帶腋芽莖段為外植體，通過單因素變量法探究何首烏叢生芽、生根和煉苗的適宜條件。結果表明，誘導何首烏外植體叢生芽的適宜配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;誘導何首烏生根的適宜配方為1/2 MS+0.1 mg/L NAA，生根率達100%;建立了道地種源德慶何首烏組培快速繁殖體系。

關鍵詞 ? ?何首烏;快速繁殖;組織培養

中圖分類號 ? ?S567.23+9 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）21-0075-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?In order to establish a rapid propagation system of Polygonum multiflorum Thunb.，provide the high-quality seedlings for production，the stems of the roots of Polygonum multiflorum Thunb. were used as explants，and the single-factor variable method was used to explore the growth of suitable conditions for buds，rooting and seedling adaptation. The results showed that the suitable formula for inducing shoots of Polygonum multiflorum Thunb. explants was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，the suitable formula for inducing rooting of Polygonum multiflorum Thunb. was 1/2 MS+0.1 mg/L NAA，the rooting rate was 100%.

Key words ? ?Polygonum multiflorum Thunb.;rapid propagation;tissue culture

中藥何首烏來源于蓼科植物何首烏（Polygonum multifl-orum Thunb.）的干燥塊根，主要成分有二苯乙烯苷、蒽醌類等[1]。

有研究表明，何首烏具有抗衰老[2]、抗抑郁[3]、抗癌[4]等作用。隨著現代工業的發展，何首烏的用途由傳統醫藥行業拓展到保健、化工等行業，具有廣闊的開發利用前景[5]。為應對何首烏資源日益減少的現狀，亟需進行何首烏人工繁殖[6]。本文以何首烏道地產區德慶種源何首烏為研究對象，建立何首烏快速繁殖體系。現將試驗結果總結如下。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

本試驗材料采自廣東省德慶縣，經廣東藥科大學中藥學院嚴寒靜教授鑒定為德慶種源何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?外植體消毒滅菌。采集何首烏的帶腋芽莖段作為外植體，用自來水沖洗20 min后，用75%乙醇浸泡30 s，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞溶液分別浸泡9、10、11、12 min（分別記為處理A1、A2、A3、A4），再用無菌水沖洗5次，把接觸消毒液兩端的損傷組織剪去，剪成長大約1.5 cm小段，每個小段帶1個腋芽。把消毒后的外植體接種于MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養基。根據0.1%氯化汞溶液處理時間不同，每組接種30瓶，每瓶接種3個外植體。在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環境下培養10 d。之后，統計外植體的染菌率和存活率，篩選出外植體消毒的適宜時間。計算公式如下：

染菌率（%）=（染菌株數/接種總株數）×100;

存活率（%）=（叢生芽成活株數/接種總株數）×100。

1.2.2 ? ?莖尖叢生芽誘導。一是不同濃度6-BA對誘導叢生芽的影響。以MS培養基為基本培養基，設定NAA濃度為0.1 mg/L，設定6-BA濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L（分別記為處理B1、B2、B3、B4）。每組接種30瓶，每瓶接種3個外植體，在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環境下培養30 d。二是不同濃度NAA對誘導叢生芽的影響。以MS培養基為基本培養基，設定6-BA濃度為篩選出的適宜濃度，設定NAA濃度分別為0.10、0.20、0.30 mg/L（分別記為處理B5、B6、B7），每組接種30瓶，每瓶接種3個外植體，在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環境下培養30 d。

1.2.3 ? ?不同6-BA和NAA組合對芽增殖的影響。采用單因素變量法，以MS培養基為基本培養基，設定NAA濃度為0.1 mg/L，設定6-BA濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L（分別記為處理C1、C2、C3、C4）。每組接種30瓶，每瓶接種3個帶1片葉子的叢生芽莖段，在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環境下培養30 d。30 d后，統計外植體的增殖系數，篩選出誘導外植體叢生芽的最佳6-BA濃度。計算公式如下：

增殖系數=芽增殖數/接種總芽數

1.2.4 ? ?生根培養。當何首烏叢生芽長到6 cm左右，轉移至含有0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mg/L NAA（分別記為處理D1、D2、D3、D4、D5、D6）的1/2 MS固體培養基中，每組接種20瓶，每瓶接種3個外植體，在光照12 h/d、溫度（25±2）℃的環境下培養15 d。計算公式如下：

生根率（%）=（生根株數/接種總株數）×100

1.2.5 ? ?煉苗移栽。當生根后的何首烏組培苗長到6 cm左右，打開瓶蓋在蔭棚中適應3 d、開蓋2～3 d后，再水培5 d，然后移栽到不同培養基質中。移栽基質分為營養土、河沙以及營養土+河沙（1∶1）3個處理（分別記為處理E1、E2、E3），每組15株，培養20 d，比較成活率和生長情況。計算公式如下：

成活率（%）=（煉苗成活株數/煉苗總株數）×100

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?不同消毒滅菌時間對外植體染菌率的影響

為了降低染菌率，需要對何首烏外植體進行消毒。由表1可知，使用75%乙醇消毒30 s，再用0.1%氯化汞溶液處理11 min，可以使何首烏的染菌率降低，存活率相對較高，達到較理想的滅菌效果。

2.2 ? ?不同6-BA和NAA組合對誘導叢生芽的影響

將何首烏外植體接種在含不同濃度外源激素組合的培養基上培養25～30 d形成叢芽。由表2可知，當NAA濃度為0.1 mg/L時，誘導叢生芽最佳的6-BA濃度為2.0 mg/L。當6-BA為2.0 mg/L、NAA為0.2 mg/L時，何首烏的增殖系數最高，達到9.94。

2.3 ? ?不同6-BA和NAA組合對芽增殖的影響

把組培苗小段接種于培養基7 d左右，可以看到何首烏開始抽芽，并且底部切口處膨大長出愈傷組織，葉子變綠，莖段變得粗壯，大約40 d形成叢芽。由此可見，芽增殖過程具有壯苗作用。由表3可知，當NAA濃度為0.1 mg/L、6-BA濃度為1.0 mg/L時，何首烏的增殖系數最高，達到6.38，小于誘導叢生芽的增殖系數。

2.4 ? ?不同濃度NAA對何首烏組培生根的影響

把何首烏組培苗帶1個側芽的莖段接種于含不同濃度NAA的生根培養基上，觀察并記錄何首烏的生根狀況，統計其生根率。由表4可知，含有NAA的培養基較不含NAA的培養基生根率高，可見NAA具有促進誘導生根的作用。低濃度的NAA對誘導何首烏生根作用較好。隨著NAA濃度的增長，大部分生根率下降。當NAA的濃度為0.1 mg/L時，何首烏的生根率最高，達到76.67%。

2.5 ? ?不同培養基質對煉苗移栽的影響

把何首烏組培苗移栽到室外的過程中，環境的溫度、適度、空氣、光照強度等都發生了較大的變化。為了增加成活率，應該讓何首烏有一個適應的過程。試驗結果顯示，在蔭棚中適應3 d、開蓋2～3 d后，水培5 d再移栽，可使何首烏的成活率達到100%。本試驗沒有具體探討適應、開蓋、水培時間對成活率的影響，主要探究了營養土、河沙以及營養土+河沙（按1∶1比例混合）3個處理組對何首烏移栽后生長狀況的影響。

把何首烏組培苗移栽后，可以觀察到有河沙培養的植株由于缺乏營養，葉子變黃、長勢緩慢、平均增加葉片數少。而處理E1、E3的何首烏生長逐漸健壯，葉子逐漸長大、變硬，綠色漸深，根須增多并且變長。營養土富含營養物質，為何首烏生長提供了適合的營養，促進了生長。由表5可知，使用營養土培養何首烏時，平均增加葉數最多，為8.2片。

3 ? ?結論與討論

試驗結果表明，當6-BA濃度為2.0 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L時，誘導何首烏叢生芽最好，與陳 ?菊等[7]、姚 ?焱等[8]的結果有所差異。不同來源的何首烏材料，其組織培養結果有差異，可能與種源不同或個體差異有關。一般來說，何首烏組培苗的煉苗成活率為90%左右。本試驗結果成活率較高的原因可能是與種源有關，也可能與組培技術有關。

試驗結果顯示，河沙的植株生長狀況較差，這是由于何首烏在生長過程中需要吸收一定的營養物質等，而河沙缺乏植物生長所需的營養物質。雖然使用營養土的增殖系數較使用營養土+河沙（按1∶1比例混合）處理的平均增加葉片數多1.6片，但是它們的生長情況都較好。如果營養土與河沙混合的比例合適，不僅能使何首烏達到較好的生長狀態，而且能夠降低成本。

把何首烏帶腋芽莖段作為外植體，最佳的消毒滅菌條件為75%乙醇消毒30 s后，再用0.1%氯化汞溶液浸泡11 min;誘導何首烏外植體叢生芽時，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L?NAA培養基較好，接種30 d后芽的增殖系數可達9.94;誘導何首烏組培苗芽增殖時，以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養基較好;誘導何首烏組培苗生根時，以1/2 MS+0.1 mg/L NAA培養基較好，接種15 d后何首烏組培苗的生根率可以達77.73%，約20 d可達100%;煉苗移栽時，在蔭棚中適應3 d、開蓋3 d后，水培5 d再移栽，可使何首烏組培苗成活率達到100%;移栽培育的最佳基質為營養土，植株生長情況更好。

4 ? ?參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：175-176.

[2] 宋士軍，李芳芳，岳華，等.何首烏的抗衰老作用研究[J].河北醫科大學學報，2003，24（2）：90-91.

[3] 暢洪昇，魯藝，王偉明，等.何首烏的抗抑郁作用及其對海馬5HT_（1A）受體表達和神經細胞發生的影響[J].北京中醫藥大學學報，2012，35 （12）：822-825.

[4] CHEN H S，LIU Y，LIN L Q，et al.Anti-proliferative effect of an extract of the root of Polygonum multiflorum Thunb. on MCF-7 human breast cancer cells and the possible mechanisms[J].Mol Med Report，2011，4（6）：1313-1319.

[5] 黃和平，王鍵，黃璐琦，等.何首烏資源現狀及保護對策[J].海峽藥學，2013，25（1）：40-42.

[6] 劉運華，王凌暉，曹福亮，等.何首烏豐產栽培技術研究進展[J].安徽農業科學，2007，35（18）：5486.

[7] 陳菊，陳國惠.6-BA與NAA濃度配比對何首烏不定芽增殖的影響[J].中國農學通報，2006，22（11）：173.

[8] 姚焱，汪珍春，王小蘭，等.廣東道地中藥何首烏的組織培養[J].北方園藝，34（7）：175-177.